lll 286 Опубликовано: 9 августа, 2018 Исследования в области механизмов действия каннабиса: endokannabinoidnaya-signalnaya-sistema-i-novye-eksperimentalnye-podhody-k-lecheniyu-dvigatelnyh-narusheniy.pdf endokannabinoidnaya-sistema-struktura-i-potentsialnye-vozmozhnosti-v-regulyatsii-massy-tela.pdf endokannabinoidy-i-eykozanoidy-biosintez-mehanizmy-ih-vzaimosvyazi-rol-v-immunnyh-protsessah.pdf modulyatory-endogennoy-kannabinoidnoy-sistemy-kak-neyroprotektory.pdf rol-endokannabinoidnyh-retseptorov-v-regulyatsii-immunnogo-otveta.pdf uchastie-endokannabinoidnoy-sistemy-v-adaptatsii-neyron-glialnyh-setey-k-faktoram-ishemii-in-vitro.pdf 1 Каннабидиол (КБД, CBD) - не психоактивен, обладает антиконвульсивным действием, препятствует развитию панических реакций. Каннабинол ( КБН, CBN) - продукт окисления ТГК, его действие примерно в 10 раз слабее. Поделиться сообщением Ссылка на сообщение Поделиться на других сайтах
lll 286 Опубликовано: 9 августа, 2018 Оригинальные статьи Медицинская иммунология 2012, Т. 14, № 3, стр. 189-194 © 2012, СПб РО РААКИ rol-endokannabinoidnyh-retseptorov-v-regulyatsii-immunnogo-otveta.pdf 1 Каннабидиол (КБД, CBD) - не психоактивен, обладает антиконвульсивным действием, препятствует развитию панических реакций. Каннабинол ( КБН, CBN) - продукт окисления ТГК, его действие примерно в 10 раз слабее. Поделиться сообщением Ссылка на сообщение Поделиться на других сайтах
lll 286 Опубликовано: 10 августа, 2018 Эндоканнабиноидная система: структура и потенциальные возможности в регуляции массы тела.Романцова Т.И., Дедов И.И., Кузнецов И.С.Кафедра эндокринологии ММА им. И.М.СеченоваСреди метаболических заболеваний в индуст- риально развитых странах ожирение по час- тоте встречаемости занимает лидирующую позицию. Распространенность ожирения, сопостави- мая с эпидемией, а также социальная значимость со- путствующих ожирению заболеваний, прежде всего, патологии сердечно-сосудистой системы, явились причиной инициации широкомасштабных исследова- ний, направленных на тщательное изучение патогене- за заболевания и поиск новых эффективных лекарст- венных препаратов.В настоящее время в процессе доклинических и клинических испытаний проводится оценка эффек- тивности и безопасности ингибиторов повторного за- хвата серотонина и нордреналина, агонистов лептина, ингибиторов гастро-интестинальной липазы, антаго- нистов нейропептида Y, агонистов адипонектина и т.д. На сегодняшний день свыше 100 молекул биологичес- ки активных веществ, принимающих участие в регу- ляции энергетического обмена, расцениваются иссле- дователями как потенциальные мишени для терапев- тического воздействия. Принципиально новым и перспективным направле- нием явилось изучение эндоканнабиноидной системы– ее структуры, рецепторов, экзогенных и эндогенных лигандов. Результаты этих исследований, в частности, легли в основу успешной разработки римонабанта – антагониста каннабиноидных рецепторов 1 типа, полу- чившего в 2006 году одобрение Управления по контро- лю за пищевыми продуктами и лекарственными сред- ствами США (Food and Drug Administration) для ис- пользования в качестве фармакотерапии ожирения и профилактики сердечно-сосудистой патологии.Основными представителями семейства эндогенных каннабиноидов являются производные арахидоновой кислоты – анандамид и 2-арахидонилглицерин. Эндо- каннабиноиды взаимодействуют с располагающимися на мембране клеток рецепторами, которые также акти- вируются под влиянием ∆9- тетрагидроканнабинола (∆9 – tetrahydrocannabinol, THC) – важнейшего компо- нента марихуаны. В США и Европе на сегодняшний день марихуана и другие дериваты конопли являются самыми распространенными нелегально используемыми наркотиками, представляющими собой экстракты растения Cannabis Sativa (Конопля посевная).В целом в состав марихуаны входит порядка 400 компонентов, 60 из которых относится к классу кан- набиноидов [5].Историческая справкаКаннабис (от лат. – Cannabis) – род растений, отно- сящихся к семейству коноплевых (Cannabaceae), вклю- чающих такие виды, как конопля посевная, либо по- лезная (Cannabis sativa), конопля индийская (Cannabis indica), конопля сорная (Cannabis ruderalis). Наркоти- ческими препаратами конопли являются высушенная травянистая часть - листья и стебли (марихуана), а так- же прессованная смесь верхушек и соцветий (анаша, гашиш, план). С древних времен конопля культивиро- валась во многих европейских странах преимуществен- но с целью изготовления из волокон растения тканей, веревок, корабельных канатов. Технология подобной переработки конопляных волокон в Китае была извест- на уже 5000 лет назад. В некоторых арабских, африкан- ских странах и Индии в основном использовалась пе- реработка цветов конопли, содержащих ТНС.Пристальное внимание европейских медиков к психоактивным эффектам конопли появилось после воз- вращения войск Наполеона из Египта, где она тради- ционно использовалась в качестве наркотика [52]. Ку- рение марихуаны сопровождалось развитием эйфории, в ряде случаев – паническими реакциями, агрессией и тяжелой интоксикацией. В Китае как наркотическое вещество конопля никогда не пользовалась особой по- пулярностью, поскольку господствующие в течение многих столетий идеи конфуцианства способствовали формированию пуританского образа жизни, в то время как марихуана могла нарушить «равновесие», «спокой- ствие» мозга и привести к «явлению дьявола». В то же время необходимо отметить, что еще в XVIII веке бри- танские медики описывали и использовали в клиниче- ской практике анальгетические, спазмолитические и орексигенные эффекты марихуаны. Запрет на использование марихуаны, установленный в 1928 г. в США, а в последующем – в большинстве европейский стран, не ослабил научного интереса к изучению психотропных эффектов конопли; более то- го, широкая распространенность наркомании в опре- деленной мере явилась побудительным стимулом к тщательному изучению нейрохимии эмоций.Несмотря на усилия многочисленных исследовате- лей, идентификация активных компонентов конопли была чрезвычайно затруднена, она состоялась значи- тельно позднее определения химической структуры та- ких наркотических веществ растительного происхож- дения, как морфин, никотин, атропин, кокаин. При- чина столь долгих поисков была вполне объективна: крайняя вариабельность индивидуальных ощущений при курении марихуаны и нестабильность используе- мых растительных экстрактов при воспроизведении экспериментов. Наконец, в 1964 году удалось изолиро- вать ∆9-тетрагидроканнабинол, в сжатые сроки были подробно изучены его психотропные эффекты [32]. В эксперименте у человека применение ТНС вызывало эйфорию, состояние внутреннего благополучия и ком- форта, изменение сенсорной чувствительности и ког- нитивных функций, нарушение ориентации во време- ни, оказывало обезболивающий и противорвотный эффект, а также способствовало повышению аппетита. Кроме того, ТНС оказывал заметное влияние на лег- кие (альвеолярная дилятация), сердце (тахикардия), сосуды (вазодилятация) и иммунную систему (подав- ление функции). У животных, помимо анальгезии, на- блюдались гипотермия, каталепсия, нарушение коор- динации – «каннабиноидная тетрада» [45].К 1986 году было синтезировано около 300 каннабиноидных аналогов ТСН, однако механизм их дейст- вия оставался неизвестным. Разработка мощного кан- набиноида CP55940, оснащенного радиоактивной меткой, впервые позволило W. A. Devane и соавт. в 1988 г. определить селективные и специфические мес- та связывания препарата в головном мозге. Иденти- фикация и клонирование соответствующих рецепто- ров, широко представленных в центральной нервной системе и названных каннабиноидными (КБ1), по- следовали двумя годами позже [46]. Существование еще одного типа каннабиноидных рецепторов – КБ2 - было определено в 1993 г.Наличие рецепторов к экзогенным каннабиноидам у млекопитающих свидетельствовало о существовании природных, эндогенных лигандов. Первый эндогенный каннабиноид был открыт в 1992 г. [23]. К удивлению ис- следователей, по структуре он оказался не белком, как исходно предполагалось по аналогии с историей изуче- ния морфина и энкефалинов, а липидом, и представлял собой амид арахидоновой кислоты и этаноламида. Первый эндоканнабиноид получил название анандамид (в переводе с Санскрита «ananda» – внутреннее блаженст- во). Второй природный лиганд каннабиноидных рецеп- торов, 2-арахидонилглицерин, был открыт через три го- да. Первые научные исследования по изучению антагониста каннабиноидных рецепторов римонабанта начи- наются в 1993 году. Таким образом, открытие каннаби- ноидной системы состоялось благодаря интеграции ре- зультатов научных исследований в области молекуляр- ной биологии, химии, структурной биологии, фармако- логии, биохимии и нейрофизиологии [44]. Кроме того, на примере исторического экскурса можно проследить, сколь длительный период времени проходит от момен- та определения механизма действия и идентификации главной субстанции до внедрения в клиническую прак- тику нового лекарственного средства на основе прин- ципов доказательной медицины.Структура и основные биологические эффекты эндоканнабиноидной системы Сформировавшаяся на ранних этапах эволюции,эндоканнабиноидная система представляет собой универсальную сигнальную структуру, обеспечиваю- щую контроль множества физиологических функций организма, включая регуляцию нервной и иммунной систем, энергетического обмена и репродукции, роста и дифференциации клеток. Основными составляю- щими эндоканнабиноидной системы являются канна- биноидные рецепторы КБ1 и КБ2, эндогенные канна- биноиды и ферменты, участвующие в процессе их би- осинтеза и деградации [19; 52]. Все звенья системы присутствуют не только у человека и высокоорганизо- ванных представителей царства животных, но и у са- мых примитивных организмов, населявших планету еще 700 млн. лет назад: моллюсков – Mytilus edulis, улиток – Aplisia californica, гидр – Hydra vulgaris, мор- ских ежей – Paracentrotus lividus [4, 10, 20, 57] и т.д. Каннабиноидные рецепторы КБ1 и КБ2 являются членами суперсемейства рецепторов, связанных с G- белком (семейство Gi/o). Отличия между двумя типа- ми рецепторов определяются последовательностью входящих в их состав аминокислот, механизмами пе- редачи сигналов, особенностями локализации, а так- же характером взаимодействия с некоторыми агонис- тами и антагонистами. Последовательность аминокислот КБ1 и КБ2 рецеп- торов идентична на 48%. В экспериментальных услови- ях определено, что проведение сигналов, активирую- щихся при взаимодействии с рецепторами эндогенных и экзогенных агонистов (растительного происхожде- ния либо синтетических каннабиноидов), может осу- ществляться с участием множества регуляторных меха- низмов: аденилатциклазы, A-, D-, Kir- типов калиевых каналов; L-, N-, P/Q– типов кальциевых каналов, ми- тоген-активированной протеинкиназы, протеин-киназ А, В и С; фосфатидил -инозитол-3-киназы, киназы фо- кальной адгезии, синтетазы оксида азота, церамида. Пути проведения сигналов определяются типом клеток и условиями эксперимента. В процессе нейромодуля- ции оба рецептора при посредничестве Gi/o -белка вза- имодействуют преимущественно с аденилатциклазой и митоген-активированной протеинкиназой. КБ1 рецеп- тор, кроме того, взаимодействует с различными типами кальциевых и калиевых каналов [38].Рецепторы КБ1 локализованы в головном и спинном мозге, периферической нервной системе, а также многих других органах и тканях. В головном мозге концентрация рецепторов КБ1 выше, чем каких-либо иных рецепторов, участвующих в процессах нейромо- дуляции; основными местами сосредоточения являют- ся кора, гиппокамп, базальные ганглии, подушка, при- лежащие ядра (n. accumbens), мозжечок, миндалина, гипоталамус. Указанные отделы головного мозга от- ветственны за когнитивные функции, эмоции, двига- тельные реакции, обработку сенсорной информации, память и гомеостаз. В минимальных количествах ре- цепторы КБ1 находятся и в стволе головного мозга, од- нако они практически отсутствуют в дыхательных цен- трах, что объясняет достаточно низкую частоту леталь- ных исходов при передозировке марихуаны [45, 68].Помимо нервной системы, КБ1 рецепторы обнару- жены в сердце, легких, эндотелии, желудочно-кишеч- ном тракте, простате, а также в костном мозге, минда- линах, селезенке и вилочковой железе. Этот вид ре- цепторов присутствует во всех органах эндокринной системы: гипоталамусе, гипофизе, щитовидной желе- зе, надпочечниках, поджелудочной железе, гонадах; кроме того, отмечена высокая экспрессия рецепторов КБ1 в жировой ткани [16, 50]. Последовательность аминокислот КБ-1 рецепторов у человека, крыс и мы- шей идентична на 97–99% [38].Рецепторы КБ2 сосредоточены преимущественно в органах и тканях, обеспечивающих иммунную реак- цию – в селезенке и ее макрофагах/моноцитах, вилоч- ковой железе, миндалинах, костном мозге, лейкоци- тах крови [38]. Убедительных сведений о возможной локализации рецепторов КБ2 в нервной ткани на се- годняшний день не получено, тем не менее, их нали- чие установлено в микроглии головного мозга [14].Предположительно, помимо двух клонированных к настоящему времени типов, существуют и другие кан- набиноидные рецепторы, структура которых пока не расшифрована – «ни КБ1, ни КБ2», или «КБ3». Так например, клетки мозга мышей с нокаутированным геном рецептора КБ1 продолжают реагировать, хотя и в меньшей степени, на введение каннабиноидного агониста WIN55212-2 [12]. Кроме того, у этих живот- ных сохраняется характерная дилятация мезентери- альных сосудов, индуцированная анандамидом [39]. Эндоканнабиноиды образуются внутри нейронов и в ряде других клеток из мембранных фосфолипидов с участием фосфодиэстераз. Процесс образования но- вых молекул происходит при деполяризации мембра- ны и последующего увеличения уровня внутриклеточ- ного Ca2+. С учетом высокой липофильности, эндо- каннабиноиды не накапливаются в везикулах и после синтеза быстро высвобождаются в межклеточное про- странство. Как правило, эндоканнабиноиды отдаля- ются от места синтеза на крайне небольшие расстоя- ния – не более 1hм [68]. После связывания с рецепто- рами активируется система вторичных мессенджеров; проведение сигналов осуществляется либо путем сни- жения активности аденилатциклазы и (применитель- но к КБ1 рецепторам) блокадой кальциевых каналов, либо стимуляции калиевых каналов [34].Среди эндоканнабиноидов, к числу которых отно- сятся анандамид, 2-арахидонилглицерин (2-АГ), эфир ноладина, O-арахидонил-этаноламин (виродгамин), N-арахидонил-дофамин и олеамид, важнейшими и на- иболее изученными на сегодняшний день являются анандамид и 2-арахидонилглицерин. Несмотря на схо- жесть структуры и основного спектра биологических эффектов, процессы метаболизма главных эндоканна биноидов имеют существенные отличия. Анандамид образуется вследствие гидролиза его предшественника N-фосфатидилэтаноламина под воздействием фосфо- липазы D [24]. Расщепление анандамида до арахидоно- вой кислоты и этаноламида осуществляется с помощью гидролазы амидов жирных кислот (ГАЖК) – микросо- мального фермента, определяемого в постсинаптичес- ких нейронах и ряде других клеток [34]. У мышей с но- каутированным геном ГАЖК определяется повышен- ный уровень анандамида и гиперчувствительность к его биологическому действию [17,18]. Синтез 2-арахидо- нилглицерина происходит путем расщепления инози- тол-1,2-диацилглицерина, катализатором является фо- сфолипаза С [11]. Деградация 2-АГ происходит при участии моноацилгицерин-липазы, локализованной в пресинаптических терминалях [27, 30]. Анандамид яв- ляется природным лигандом для КБ1 рецепторов, 2-АГ активирует оба типа каннабиноидных рецепторов.Большой интерес у исследователей вызывает воз-можность функциональной взаимосвязи КБ1 рецеп- торов и рецепторов 5-гидрокситриптамина, дофами- на, орексинов, а также взаимодействия анандамида с ваниллоидными рецепторами, располагающимися в ряде ноцицептивных нейронов [2; 62].Необходимо отметить, что в целом эндоканнабино- идная система проявляет свои модулирующие эффек- ты лишь в тех органах и в тот момент, когда она вос- требована. Это определяет существенную разницу между эндоканнабиноидами и результатами экспери- ментальных работ с использованием экзогенных аго- нистов каннабиноидных рецепторов, не обладающих должной мобильностью и селективностью [50].В реализации эффектов эндоканнабиноидов задей- ствованы различные механизмы. В центральной нерв- ной системе эндоканнабиноиды выступают в качестве нейротрансмиттеров и нейромодуляторов. Классичес- кие нейротрансмиттеры под воздействием нейрональ- ного импульса высвобождаются из везикул пресинап- тических терминалей, диффундируют через синапти- ческую щель и взаимодействуют с расположенными на постсинаптических нейронах рецепторами. В отли- чие от них эндоканнабиноиды тотчас после синтеза высвобождаются из постсинаптических нейронов и направляются к пресинапическим терминалям, где локализованы КБ1 рецепторы (ретроградная сигнали- зация). Основное влияние заключается в подавлении продукции таких нейротрасмиттеров, как глютамат и гамма-аминомасляная кистота (ГАМК) [30]. Эндоканнабиноиды могут потенцировать аутокринные сигналы медиаторов, ингибирующие актив- ность клеток нервной системы, как, в частности, было показано на примере ГАМК-эргических нейронов ко- ры головного мозга [7]. Эндоканнабиноиды способны оказывать пара- и аутокринное действие (без вовлечения синаптической трансмиссии). Такой эффект отмечается преимущест- венно в клетках глии, адипоцитах и печени [59]. Поскольку эндоканабиноиды наряду с КБ1 рецеп- торами могут располагаться и внутриклеточно, нельзя исключить возможность существования соответству- ющих внутриклеточных сигналов [50].Регуляция энергетического балансаПостоянство массы тела у здорового человека под- держивается благодаря взаимодействию множества центральных и периферических механизмов. Стимули- рующее действие марихуаны на аппетит было известно с древнейших времен. С учетом того, что приоритетом первоначальных научных разработок являлось изуче- ние головного мозга, предполагалось, что каннабинои- ды обладают исключительно центральным действием на регуляцию массы тела. В исследовании D. Cota и со- авт. (2003) убедительно показано, что эндоканнабино- идная система оказывает влияние на энергообмен как с помощью центральных орексигенных эффектов, так и путем периферической регуляции липогенеза. Как установлено в настоящее время, эндогенные каннабиноиды регулируют энергетический баланс в организме на ключевых функциональных уровнях, в которых задействованы: 1) лимбическая система (ге- донистический эффект пищи), 2) гипоталамус (интег- ративные функции), 3) желудочно-кишечный тракт,4) жировая ткань.Центральные механизмы контроля энергетического балансаИнтерпретация результатов ранних научных ис- следований, посвященных изучению роли каннаби- ноидов в регуляции аппетита и массы тела, была чрезвычайно затруднительной вследствие широкого спектра активности различных дериватов марихуа- ны, дозировок и способов их назначения. Например, у экспериментальных животных использование ТНС в дозе, превышающей 10 мг/кг, сопровождается не увеличением, а снижением приема пищи [50]. Как оказалось, большие дозировки приводят к проявле- нию преимущественно седативных свойств препара- та, нивелирующих орексигенные эффекты; это объ- ясняет парадоксальные на первый взгляд выводы публикаций, датированных 1965–1975 годами. В об- зорной работе E.L. Abel (1975), повышение аппетита под влиянием каннабиноидов отмечено лишь в 3 из 25 экспериментальных работ.При стандартизации методов исследований былодоказано, что активация КБ1 рецепторов под влияни- ем фито- и эндоканнабиноидов стимулирует прием пищи даже у сытых животных [67]. Назначение анта- гониста КБ1 рецепторов SR141716 (рибонабант) по- давляет аппетит и снижает массу тела у эксперимен- тальных животных и человека. Мыши с нокаутиро- ванным геном КБ1 по сравнению с контролем съеда- ют гораздо меньше пищи после периода депривации еды [25]. Фармакологическая блокада КБ1 рецепторов у новорожденных мышей с помощью римонабанта в первые сутки постнатального периода приводит к прекращению сосания молока и голодной смерти [31]. Результаты многочисленных экспериментальных работ, благодаря которым был подтвержден отчетли- вый орексигенный эффект канабиноидов у здоровых добровольцев, послужили обоснованием к регистра- ции в США тетрагидроканнабинол-содержащего пре- парата дронабинол (Маринол) для симптоматической терапии заболеваний, сопровождающихся снижением аппетита и истощением: рака различной локализации, ВИЧ – инфекции, болезни Альцгеймера [8, 66].Контроль аппетита под влиянием каннабиноидов обеспечивается двойным механизмом: 1) активация мезолимбической системы, ответственной за эмоцио- нальное состояние; 2) взаимодействие с гипоталами- ческими структурами, регулирующими баланс энер- гии. Инъекции анандамида в мезолимбические и ги- поталамические зоны стимулируют прием пищи у крыс. Кроме того, уровень эндогенных каннабинои- дов в этих структурах мозга повышен при голодании и снижен во время приема пищи. Подобные колебания не зарегистрированы в отделах ЦНС, которые не уча- ствуют в регуляции энергообмена [41].Регуляция аппетита на уровне мезолимбической системыКак у животных, так и у человека под влиянием каннабиноидов повышается мотивация к приему осо- бо вкусной (сладкой либо жирной) пищи. Блокада эн- доканнабиноидной системы под влиянием римона- банта сопровождается подавлением положительного подкрепления эмоций при приеме вкусной еды, а так- же при использовании наркотических веществ, в том числе алкоголя и никотина [29, 43].Прием пищи, как один из видов получения удо- вольствия, является мощным орексигенным стимулом даже при отсутствии дефицита энергии в организме. Чувство удовольствия, удовлетворения и положитель- ного подкрепления обеспечивается благодаря ком- плексному взаимодействию целого ряда сигнальных систем: опиоидной, дофаминергической, серотони- нергической. Эндоканнабиноидная система принимает участие в поведенческих реакциях, связанных с активацией си- стемы удовлетворения / подкрепления. Это подтверж- дается высоким уровнем экспрессии рецепторов КБ1 в соответствующих отделах головного мозга. Система удовлетворения / подкрепления у млекопитающих представлена рядом синаптически взаимосвязанных структур головного мозга, включающих медиальный передний мозговой пучок, вентральную тегменталь- ную область, прилежащие ядра и бледный шар. Ука- занные структуры вовлечены в процессы получения удовлетворения от физиологических стимулов, на- правленных на выживание вида (прием пищи, секс), а также являются нейрональным субстратом наркоти- ческой зависимости [33] Важнейшей морфофункциональной основой системы удовлетворения является мезолимбическая до- фаминергическая система. Уровень дофамина в при- лежащих ядрах повышается во время приема вкусной пищи, антагонисты дофамина снижают аппетит [55]. Присутствие каннабиноидов и рецепторов КБ1 отме- чено в тех же зонах лимбической системы переднего мозга, где сосредоточены рецепторы дофамина Д1 и Д2. Психоактивные вещества (марихуана, алкоголь), а также стимулы удовольствия от приема вкусной пищи индуцируют выработку дофамина. Учитывая наличие тесной корреляции между концентрациями дофами- на, эндоканнабиноидов и пристрастием к особо при ятной еде, предложена гипотеза о существовании вза- имосвязи между каннабиноидной и дофаминергичес- кой системами в регуляции пищевого поведения [65]. Подобная связь прослеживается и с эндогенными опиоидными пептидами, принимающими участие в контроле аппетита. Дефицит энкефалина либо b-эн- дорфина приводит к потере вкусовых ощущений у мышей; у человека при назначении опиоидных анта- гонистов также снижается восприятие вкуса еды, при этом чувство голода сохранено [69]. Совместное на- значение антагониста опиоидных рецепторов налок- сона и римонабанта сопровождается снижением при- ема пищи с синерегическим эффектом. Необходимо отметить, что реализация взаимодействия осуществ- ляется на гипоталамическом уровне: римонабант по- давляет индуцированное морфином орексигенное действие лишь при введении опиоида непосредствен- но в паравентрикулярные ядра гипоталамуса, при инъекциях в прилежащие ядра мезолимбической сис- темы пищевое поведение у экспериментальных животных не меняется [65] .Применение антагонистов КБ1 рецепторов у крыс в комбинации с дексфенфлюрамином приводит к до- полнительному (но не синергическому) анорексиген- ному эффекту. Таким образом, несмотря на наличие отчетливой связи между эндоканнабиноидной и серо- тонинергической системами, существуют и независи- мые механизмы их действия [54]. Этот вывод имеет особую значимость, поскольку заранее можно исклю- чить потенциальный синергический эффект совмест- ного назначения римонабанта и сибутрамина в каче- стве комбинированной фармакотерапии ожирения. Регуляция аппетита на гипоталамическом уровне Гипоталамус является важнейшим координатором энергетического обмена. Дугообразные ядра гипота- ламуса содержат два дискретных пула нейронов. Один пул нейронов, продуцирующий нейропептид Y (НПY) и агути-подобный белок (АПБ), стимулирует аппетит и повышает массу тела, т.е. оказывает анаболическое воздействие, другой пул клеток, секретирующий про- опиомеланокортин (ПОМК) и кокаин-амфетамин- регулируемый транскрипт (КАРТ), подавляет процес- сы потребления пищи, т.е. обладает катаболическим эффектом. Эти группы клеток дугообразных ядер в первую очередь получают и преобразовывают посту- пающую с периферии информацию о состоянии энер- гетического баланса, в связи с чем их относят к нейро- нам первого порядка. Обе группы нейронов связаны с паравентрикулярными ядрами, вентромедиальными ядрами, дорсомедиальной, латеральной и перифорни- кальной областью гипоталамуса, где содержатся ней- роны второго порядка, так же участвующие в регуля- ции пищевого поведения и расхода энергии [1].Лептин – гормон, секретируемый адипоцитами. В дугообразных ядрах гипоталамуса лептин ингибирует активность НПY/АПБ – содержащих нейронов и сти- мулирует ПОМК/КАРТ – продуцирующие нейроны, что приводит к подавлению аппетита. Функциональная взаимосвязь между эндоканнаби- нидной системой и лептином отражена в исследова ниях Di Marzo и соавт. (2001). Введение лептина здо- ровым грызунам сопровождается снижением уровня анандамида и 2-арахидонилглицерина в гипоталаму- се, в то время как у мышей с генетически обусловлен- ной лептинорезистентностью концентрация эндокан- набиноидов повышена. Римонабант снижает аппетит у всех этих животных [25]. Грелин представляет собой пептидный гормон, синте- зируемый преимущественно в желудке и оказывающий мощное орексигенное действие. В гипоталамусе рецеп- торы грелина локализованы преимущественно в дугооб- разных, паравентрикулярных и вентромедиальных ядрах. При введении грелина непосредственно в паравентрику- лярные ядра у подопытных крыс объем потребляемой пищи увеличивается вдвое. Орексигенный эффект гре- лина блокируется при назначении римонабанта в крайне низкой дозе, которая в обычных условиях не влияет на аппетит. Эти данные свидетельствуют, что эндоканнаби- ноидная система непосредственно либо косвенно задей- ствована в проведении сигналов грелина [60]. Отмечена высокая концентрация рецепторов КБ1 в зонах гипоталамуса, секретирующих кортиколиберин (паравентрикулярные ядра), кокаин-амфетамин-регу- лируемый транскрипт (дорсомедиальные ядра), мела- нин-концентрирующий гормон (латеральные отделы) и пре-проорексин (вентромедиальный гипоталамус). Установлено наличие взаимосвязи между этими важ- нейшими медиаторами энергообмена. Например, при делеции гена рецепторов КБ1 наблюдается повыше- ние экспрессии кортиколиберина, обладающего от- четливым анорексигенным эффектом [15, 16]. Совме- стное назначение римонабанта и агонистов рецепто- ров меланокортина 4 типа сопровождается синергиче- ским действием на пищевое поведение [64]. Актива- ция каннабиноидных рецепторов 1 типа приводит к усилению проведения сигналов орексина А путем сен- ситизации его рецепторов [37]. Вблизи нейронов, продуцирующих нейропептид Y, присутствия рецепторов КБ1 не выявлено. Кроме то- го, римонабант способен эффективно снижать аппе- тит у мышей с нокаутированным геном НПY. Это при- водит к выводу, что орексигенные эффекты каннаби- ноидов не связаны с действием НПY [16]. Периферические механизмы регуляции метаболизма В процесс регуляции массы тела при блокаде эндо- каннабиноидных рецепторов 1 типа вовлечены не толь- ко центральные, но и периферические механизмы. Масса тела мышей с нокаутированным геном КБ1 гораздо меньше, чем у особей в популяции, с помо- щью МР-томографии установлено отчетливое сниже- ние объема жировых отложений [49]. В исследовании Cota D. и соавт. (2003) отмечено, что лишь у молодых мышей линии КБ1 -/- снижение массы тела объясни- мо прежде всего снижением аппетита, у взрослых жи- вотных изменение энергетического баланса происхо- дит преимущественно вследствие активации ряда ме- таболических процессов. Даже на фоне высококалорийного питания у мышей линии КБ1 -/- не меняется пищевое поведение; не развивается ожирение, инсулинорезистентность и дислипиде- мия. Назначение римонабанта грызунам с индуцирован- ным алиментарным ожирением приводит к временному анорексигенному действию, которое в последующем ос- лабевает, однако наблюдается выраженное прогрессиру- ющее снижением массы тела; при этом восстанавлива- ются нормальные значения уровня лептина, инсулина, гликемии, триглицеридов, ЛПНП, ЛПВП [53]. Таким образом, фармакотерапия ожирения с ис- пользованием антагонистов рецепторов КБ1 оказыва- ет двойственное действие, затрагивающее как цент- ральную нервную систему, так и периферические ор- ганы, участвующие в процессах накопления энергии и ее утилизации. Экспрессия рецепторов КБ1 в зрелых клетках жи- ровой ткани выше, чем в преадипоцитах, соответст- венно, не исключено, что активация рецепторов КБ1 более значима для обеспечения метаболических про- цессов, чем для дифференциации адипоцитов [28]. В условиях in vitro показано, что агонисты рецепторов КБ1 в адипоцитах белой жировой ткани стимулируют липогенез путем активации липопротеиновой липазы, этот эффект под влиянием римонабанта блокируется [Cota D. et al., 2003]. Кроме того, римонабант повыша- ет экспрессию транспортеров глюкозы 4 типа в жиро- вой ткани, что определяет новые перспективы в лече- нии сахарного диабета 2 типа [40]. К числу важнейших эффектов римонабанта отно- сится его способность повышать секрецию адипонек- тина в адипоцитах, что было показано в экспериментах у тучных мышей линии Zucker [9]. Адипонектин по- давляет продукцию глюкозы печенью, снижает уро- вень свободных жирных кислот путем активации их окисления и блокады липогенеза. Наиболее вероятной причиной усиления секреции адипонектина является индуцированное римонабантом снижение массы тела. Предположительно, блокада эндоканнабиноидной системы сопровождается усилением термогенеза. Под влиянием антагониста КБ1 АМ251 наблюдается повы- шение экспрессии мРНК белков, разобщающих окислительное фосфорилирование в бурой жировой ткани UCP-1 UCP-3 [58]. Однако, с учетом способности канна- биноидов стимулировать секрецию норадреналина в ги- поталамусе, возможно, что усиление энергозатрат опо- средовано активностью симпатической системы [61]. При применении римонабанта в течение 7 дней в изолированных мышцах отмечается существенное по- вышение утилизации глюкозы, чем частично могут быть обусловлены положительные эффекты препара- та на показатели углеводного обмена [42]. Содержание 2-арахидонилглицерина в гепатоцитах вдвое выше, чем в каких-либо иных клетках перифери- ческих органов [36]. Таким образом, печень представля- ет собой еще один орган-мишень для каннабиноидной системы. Предположительно, путем активации адени- латциклазы синтетический каннабиноид HU210 стиму- лирует экспрессию ряда генов, вовлеченных в синтез жирных кислот, в частности, таких как фактора транс- крипции SREBP-1с, ацетил-КоА карбоксилазы 1, синтетазы жирных кислот [48]. Римонабант подавляет процесс липогенеза в печени, что может быть использо- вано в качестве профилактики или лечения стеатоза [56]. Эндоканнабиноиды и рецепоры КБ1 имеют высо- кий уровень экспрессии в нейронах желудочно-кишеч- ного тракта. Во время голодания концентрация ананда- мида повышается в 7 раз с последующим возвращени- ем к базальным значениям после приема пищи [35]. Афферентные нейроны блуждающего нерва, проеци- рующиеся в желудок и 12-перстную кишку, содержат как рецепторы КБ1, так и рецепторы холецистокини- на, который играет важную роль в формировании чув- ства насыщения. Экспрессия рецепторов КБ1 в гангли- ях повышается при депривации пищи и снижается в сытом организме. Вариабельность концентрации ре- цепторов КБ1 блокируется под действием холецисто- кинина. Высказывается предположение, что регуляция пищевого поведения эндоканнабиноидной системой может осуществляться во взаимодействии с сигналами желудочно-кишечного тракта [13]. Механизм действия римонабанта в целом представлен на рис. 1. Активация эндоканнабиноидной системы при ожирении В гипоталамусе у тучных мышей линий ob/ob, db/db, а также у крыс линии Zucker отмечается повышение содержания 2-арихидонилглицерина. Высокая кон- центрация анандамида и рецепторов КБ1 обнаружена в печени мышей с индуцированным алиментарным ожирением [26]. S. Engeli и соавт. (2005) сравнивали содержание концентрации основных эндоканнабиноидов, их инактивирующего фермента – гидролазы амида жир- ных кислот и экспрессию рецепторов КБ1 в жировой ткани у женщин с нормальной массой тела и при на- личии ожирения. У женщин, страдающих ожирением, уровни анандамида и 2-АГ были повышены на 35% и 52% соответственно по сравнению с группой контро- ля. Экспрессия мРНК каннабиноидных рецепторов при ожирении была ниже на 34%, мРНК гидролазы жирных кислот – на 59%, причем снижение массы те- ла на 5% не влияло на эти показатели [28]. По мнению Di Marzo V., Matias I. (2005), хроничес- кая гиперактивность эндоканнабиноидной системы ограничивает возможности организма поддерживать постоянство энергетического обмена и вносит весо- мый вклад в патогенез ожирения и метаболического синдрома. Основными причинами повышения тонуса эндоканнабиноидной системы, предположительно, являются возрастание уровня арахидоновой кислоты (предшественника эндоканнабиноидов) при избыточ- ном содержании жира в рационе, лептино- и инсули- норезистентность, генетические нарушения механиз- мов инактивации эндоканнабиноидов; нарушения ре- гуляции медиаторов энергетического обмена, функ- ционально связанных с эндоканнабиноидами. Результаты клинических исследований эффективности и безопасности римонабанта . На данный момент завершен ряд многоцентровых клинических исследований, посвященных оценке эф- фективности и безопасности римонабанта – антагони- ста каннабиноидных рецепторов 1 типа. Наиболее мас- штабным проектом в рамках III фазы клинических ис- пытаний является стартовавшая в 2001 году программа RIO (Rimonabant In Obesity), в которую было включено более 6600 больных с избыточной массой тела или ожи- рением из медицинских центров Европы, Канады, США. В структуру программы вошли исследования RIO-Europe, RIO-North America, RIO-Diabetes, RIO- Lipids; основной целью явилось изучение влияния ри- монабанта на динамику массы тела и риск сердечно-со- судистых заболеваний. Всем участникам было реко- мендовано уменьшить суточную калорийность пищи на 600 ккал. После рандомизации в основных группах назначался римонабант однократно в дозе 5 мг или 20 мг в сутки, в группе контроля – плацебо. В исследование RIO-Europe было включено 1570 пациентов с ИМТ от 30 кг/м2 и более, а также с ИМТ свыше 27 кг/м2 в сочетании с гипертензией и/или дис- липидемией. После рандомизации пациентам в ос- новных группах назначался римонабант в дозе 20 мг или 5 мг, в группе контроля – плацебо. Продолжи тельность наблюдения составила 2 года, к настоящему моменту подведены итоги первых 48 недель. К концу года на фоне приема римонабанта в дозе 20 мг снижение массы тела на 5% от исходных значений отмечено у 70% человек (на фоне 5 мг препарата – у 44,2%, на фоне плацебо – у 30,5%); на 10% масса тела снизилась у 39% больных (на фоне 5 мг препарата – у 15,3%, на фоне плацебо – у 10,4%). В среднем динами- ка массы тела в группах, получавших 20 мг препарата, 5 мг либо плацебо составила соответственно -8,6 кг,-4,5 кг и -3,6 кг; динамика окружности талии -8,6 см,-5,8 см и -4,5 см. За период наблюдения у больных, по- лучавших 20 мг препарата, отмечено увеличение уров- ня ЛПВП на 27% (vs. 14% на фоне плацебо), а также снижение концентрации триглицеридов на 10,6% (в контрольной группе показатели возросли на 5%) [63]. Сходные критерии включения были использованы в исследовании RIO-North America, продолжавшемся в течение двух лет; объем выборки составил 3040 чело- век. Основной целью исследования явилась оценка динамики массы тела (первый год наблюдения) и про- филактика повторного набора веса (второй год). В те- чение года больные получали римонабант (20 мг, 5 мг) или плацебо, затем в основных группах проводилась повторная рандомизация. Прежние дозы препарата сохранялись у половины пациентов, остальные были переведены на плацебо. В группе контроля тактика ве- дения больных не менялась. Снижение веса на 5% от исходного наблюдалось у 62,5% пациентов, получавших 20 мг римонабанта в те- чение двух лет (vs. 33,2% на фоне плацебо), снижение массы тела на 10% отмечено у 32,8% (vs. 16,4% в кон- троле). У пациентов, принимавших в течение второго года наблюдения вместо римонабанта плацебо, масса тела вновь возрастала. Исходно критериям метаболического синдрома со- ответствовали 34,8% человек в группе, получавшей 20 мг римонабанта (31,7% в контрольной группе), через 2 года лечения вследствие уменьшения окружности та- лии, снижения уровня триглицеридов, ЛПНП и воз- растания ЛПВП этот показатель составил 22,5% (vs. 29,2% на плацебо). Результаты данной работы были обсуждены в 2004 г. на заседании Американской кар- диологической Ассоциации [26]. Выборка для исследования RIO-Lipids формирова- лась на основании наличия у пациентов избыточного веса или ожирения (ИМТ от 27 до 40 кг/м2) и выра- женной дислипидемии (уровень триглицеридов от 1,7 до 7,9 ммоль/л и/или индекс атерогенности свыше 4,5 у женщин и свыше 5 у мужчин). В исследовании при- няло участие 1036 человек в возрасте от 18 до 79 лет. Через год, к моменту завершения исследования, в среднем масса тела снизилась на 8,8 кг у больных на фоне 20 мг римонабанта и на 2 кг у получавших плаце- бо. Доля больных с метаболическим синдромом бла- годаря римонабанту уменьшилась с 52,9 до 25,8% (в контрольной группе – до 41%). На фоне применения антагониста КБ1 рецепторов отмечено статистически значимое увеличение уровня адипонектина, а также прогрессирующее снижение концентрации лептина и С-реактивного белка [21]. Динамика массы тела у больных с ожирением на фоне римонабанта по дан- ным исследований RIO-Lipids, RIO-North America, RIO-Europa представлена на рис. 2. В исследовании RIO-Diabetes принимали участие 1045 пациентов, страдающих сахарным диабетом 2 ти- па, с декомпенсацией заболевания на фоне перораль- ной сахароснижающей терапии (метформин либо пре- параты сульфонилмочевины). К концу периода наблю- дения длительностью 1 год в группе больных, получаю- щих помимо прежней сахароснижающей терапии ри- монабант в дозе 20 мг, масса тела снизилась на 5,3 кг, ок- ружность талии уменьшилась на 5,2 см. В контрольной группе, получавшей метформин либо препараты суль- фонилмочевины в сочетании с плацебо, больные поху- дели на 1,4 кг; окружность талии изменилась на -1,9 см. Доля больных, достигших целевого уровня глики- рованного гемоглобина (менее 6,5%), при подключе- нии римонабанта составила 42%, что вдвое превыша- ло численность больных с удовлетворительным пока- зателями углеводного обмена на плацебо (20,8%). На фоне препарата уровень HbA1c был ниже на 0,7%, чем в контроле. При проведении линейного регрессион- ного анализа данных у пациентов с эквивалентной по- терей веса было установлено, что снижение HbA1c лишь на 0,3% обусловлено динамикой массы тела, ос- тальные 0,4%, по мнению исследователей, связаны с непосредственными эффектами римонабанта. Кроме того, на фоне римонабанта отмечено увеличение уровня ЛПВП на 15,4% по сравнению с 7,1% в кон- трольной группе. Уровень триглицеридов снижался на 9,1% и 7,3% соответственно в группах, получавших 20 мг препарата либо плацебо [50]. Побочные эффекты при проведении исследований программы RIO по характеру проявлений были сопо- ставимы во всех группах. Суммарно частота нежела- тельных явлений у больных, получавших римонабант, была на 3,6% выше, чем в контрольной группе. На фо- не приема препарата количество выбывших из иссле- дования больных вследствие побочных эффектов бы- ло больше в среднем на 5,9%. Наиболее типичными побочными эффектами были тошнота (+1,3%), диа- рея (+1,3%), головокружение (+0,6%) тревога (+0,7%), депрессия (+1,4%). Однако, как отмечают исследователи, побочные эффекты были кратковре- менные и проходили в течение 2-3 недель после нача- ла приема препарата [26]. По мнению экспертов ВОЗ, курение и ожирение на сегодняшний день являются ведущими среди потен- циально устранимых причин летальных исходов вследствие сердечно-сосудистой патологии. В ходе клинических исследований продемонстрирована эф- фективность римонабанта не только при метаболиче- ском синдроме, но и при никотиновой зависимости. В исследование STRATUS-US (STudies with Rimonabant And Tobacco USe – US) было привлечено 787 заядлых курильщиков. Участники, взятые под наблюдение, курили в среднем по 23 сигареты в день и имели в анамнезе порядка 4 попыток самостоятель- ного отказа от курения. Помимо данных анамнеза, наличие никотиновой зависимости подтверждалось путем оценки содержания моноксида углерода в вы- дыхаемом воздухе и уровня котинина в плазме. Пред- варительно в течение недели проводились беседы о вреде курения, после чего были сформированы груп пы, получавшие римонабант (20 мг или 5 мг) или плацебо. Исследование продолжалось в течение 10 недель; первые две недели участникам разрешалось курить без ограничения, затем были возобновлены активные рекомендации избавиться от вредной при- вычки. Исследование показало, что 36,2 % человек, получавших 20 мг римонабанта, полностью отказа- лись от курения (vs. 20,6% и 20,2% – плацебо и римо- набант 5 мг, соответственно). В среднем на фоне 20 мг препарата снижение массы тела составило 0.5 кг, в то время как в группе получавших плацебо, отмеча- лось увеличение веса на 2,1 кг. Снижение веса отме- чалось преимущественно у участников с наличием ожирения. Таким образом, римонабант облегчает от- каз от курения без рикошетной прибавки массы тела. Оценка эффективности римонабанта при никотино- вой зависимости в настоящее время продолжается в исследованиях STRATUS – Europe и STRATUS –Worldwide. Суммарно в исследования программы STRATUS включено свыше 6500 человек [6]. Заключение Эндоканнабиноидная система играет важнейшую роль в патогенезе ожирения. Многие аспекты био- логических эффектов эндоканнабиноидной систе- мы были уточнены именно благодаря открытию ри- монабанта – первого антагониста каннабиноидных рецепторов 1 типа. Блокада каннабиноидных рецеп- торов как в центральной нервной системе, так и в периферических органах способствует восстановле- нию регуляции энергетического обмена. Примене- ние в клинической практике представителя нового класса лекарственных препаратов римонабанта от- крывает широкие перспективы по профилактике множественных факторов риска сердечно-сосудис- тых заболеваний. Каннабидиол (КБД, CBD) - не психоактивен, обладает антиконвульсивным действием, препятствует развитию панических реакций. Каннабинол ( КБН, CBN) - продукт окисления ТГК, его действие примерно в 10 раз слабее. Поделиться сообщением Ссылка на сообщение Поделиться на других сайтах
lll 286 Опубликовано: 10 августа, 2018 ЭНДОКАННАБИНОИДЫ И ЭЙКОЗАНОИДЫ: БИОСИНТЕЗ, МЕХАНИЗМЫ ИХ ВЗАИМОСВЯЗИ, РОЛЬ В ИММУННЫХ ПРОЦЕССАХ. Караман Ю.К., Лобанова Е.Г. Владивостокский филиал ФГБУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» СО РАМН – НИИ медицинской климатологии и восстановительного лечения, г. Владивосток, Россия Резюме. Обзор посвящен современным представлениям о метаболитах арахидоновой кислоты – эндоканнабиноидам и эйкозаноидам, путях их биосинтеза, механизмах взаимодействия и роли в им- мунных процессах. Приводятся новые данные литературы и результаты собственных исследований о перекрестности ферментативных путей биосинтеза эндоканнабиноидов и эйкозаноидов; влиянии синтетических лигандов каннабиноидных рецепторов на активность продукции провоспалительных цитокинов, эйкозаноидов; взаимосвязи между реактивностью иммунной системы и уровнем экс- прессии эндоканнабиноидных рецепторов. В последнее время большой интерес представ- ляют исследования различных сигнальных пу- тей регуляции иммунного ответа. Важное место в клеточно-молекулярных механизмах функцио- нирования иммунной системы отводится особым медиаторам – эндоканнабиноидам и эйкозанои- дам (оксилипины). Данные медиаторы относятся к группе биологически активных веществ липид- ной природы, выполняющих множество функ- ций в организме [10, 20, 25, 30, 46, 58]. Известна роль эйкозаноидов, их ферментов и рецепторов в развитии многих хронических заболеваний [27, 31, 57, 64]. Появляются единичные данные об участии эндоканнабиноидной системы в им- мунных процессах [28, 38, 40, 44]. Субстратом для биосинтеза эндоканнабиноидов и эйкозано- идов служат фосфолипиды (ФЛ), содержащие арахидоновую кислоту (AК) (рис. 1) [7, 13, 56]. Общность эндоканнабиноидов и эйкозанои- дов заключается также в использовании одних и тех же ферментных систем в процессе метабо- лизма [56]. Учитывая это, можно предположить потенциальную взаимосвязь между сигнальной функцией эндоканнабиноидов и эйкозаноидов, их совместную роль в иммунных процессах. Од- нако попытки ученых провести анализ функций и взаимодействий этих сигнальных систем име- ют неоднозначный вывод. Остаются открыты- ми многие вопросы относительно механизмов взаимосвязи между вторичными мессенджерами эндоканнабиноидной и эйкозаноидной приро- ды, особенностей их функционирования в нор- ме и патологии. Обзор посвящен современным представлениям о метаболитах арахидоновой кислоты – эндоканнабиноидах и эйкозаноидах, путях их биосинтеза, механизмах взаимодействия и роли в иммунном ответе. Синтез эйкозаноидов Природа эйкозаноидов установлена в 1957 г., когда С. Бергстрёму удалось выделить из везику- лярных желез барана два вещества, которые были названы простагландинами F и E (PG). Термин «простагландин» ввел лауреат Нобелевской пре- мии в области физиологии и медицины в 1970 г. У. фон Эйлер. В 1964 г. С. Бергстрём и ван Дорп доказали, что предшественниками простаглан- динов является арахидоновая кислота, высво- бождаемая из фосфолипидов [12, 65]. В 1976 г. Монкада сообщил об обнаружении вещества, препятствующего образованию тромбов и спо- собного расширять сосуды. Впоследствии это вещество назвали простагландином I, или про- стациклином. Таким образом, к эйкозаноидам можно отнести большую группу молекулярных медиаторов, синтезирующихся преимуществен- но из арахидоновой кислоты. Известны три фер- ментативных пути окисления AК – с участием мембранно-связанной циклооксигеназы (COX), цитоплазматических липоксигеназ (LOX) и эпок- сигеназ (цитохром-Р-450-подобных ферментов) [32, 57, 58, 62]. В зависимости от фермента, уча- ствующего в синтезе эйкозаноида, различают простаноиды (простагландины, тромбоксаны – ТX), которые метаболизируются COX, и лейко- триены (LТ), образующиеся при действии LOX [33, 43, 48, 59] (рис. 2). Синтез эйкозаноидов по циклооксигеназному пути начинается с включения двух атомов кисло- рода в молекулу AК и образования нестабильных промежуточных продуктов – эндоперекисей. Да- лее в результате последовательных реакций с уча- стием простагландин-I2-синтазы эндоперекиси могут превращаться в простагландин-I2 или про- стациклин, а при действии тромбоксан-А2- синтазы – в тромбоксан А2 (рис. 3). Различают две изоформы COX – COX-1 и COX-2. Предпо- лагают, что COX-1 – это конститутивная форма фермента, которая регулирует гомеостатические функции организма, тогда как экспрессия COX- 2 наблюдается при воспалении [59]. Ассоциация COX с воспалительной реакцией привела к раз- работке COX-селективных ингибиторов. Обе изоформы COX подавляются нестероидными противовоспалительными препаратами, такими как аспирин, ибупрофен и индометацин. В метаболизме АК важное значение играет 5-липоксигеназа, под действием которой обра- зуется нестабильное соединение – лейкотриен А4 [22, 48]. Это промежуточное соединение является субстратом для двух различных ферментов: лей- котриен А4-гидролазы и лейкотриен С4-синтазы, образующих лейкотриен B4 и С4. Под действием глутаминил-трансферазы лейкотриен С4 превра- щается в лейкотриен D4, который в свою очередь под действием пептидазы превращается в лейко- триен LTE4. В отличие от циклооксигеназы, при- сутствующей в конститутивной и индуцируемой формах в большинстве типов клеток, 5-липоок- сигеназа – менее распространенный фермент. К высоко биологически активным мета- болитам АК можно отнести 5,6-, 8,9-, 11,12- и 14,15-эпоксиэйкозатриеновые и 20-гидрок- сиэйкозатетраеновые кислоты, образующиеся в системе цитохрома Р450 [62]. Цитохром Р450 – универсальная гемсодержащая монооксигеназа, играющая важную роль в окислении многочис- ленных соединений, как эндогенных (стероиды, желчные кислоты, жирные кислоты, простаглан- дины, лейкотриены, биогенные амины), так и экзогенных (лекарства, яды, продукты промыш- ленного загрязнения, пестициды, канцерогены, мутагены и т.п.). Монооксигеназные метаболиты АК обладают широким спектром действия, часто разнонаправленной активностью [27]. Синтез эндоканнабиноидов Научный интерес к каннабиноидам возрос в 60-е гг. 20-го века, когда был обнаружен ком- понент конопли Ä9-тетрагидроканнабинол (ТГК) [29]. В 1988 г. в ткани мозга удалось обнаружить специфические участки связывания для ТГК, по- лучившие название каннабиноидных рецепторов 1 типа (СВ1) [18]. В 1990 г. был идентифициро- ван каннабиноидный рецептор 2 типа (CB2) [19]. В последующем было показано, что каннабино- идные CB1-рецепторы локализуются в структурах периферической и центральной нервной систем, участвуют в процессах проведения и восприятия ноцицептивных сигналов. СВ2-рецепторы экс- прессируются преимущественно на иммуноком- петентных клетках, где они опосредуют иммуно- модулирующий эффект [23, 45, 51]. Идентифицикация лигандов каннабиноид- ных рецепторов явилась следующим этапом в изучении механизмов действия каннабинои- дов. В 1992 г. было показано, что этаноламид ара- хидоновой кислоты (арахидоноилэтаноламид) или анандамид является эндогенным лигандом каннабиноидных рецепторов [18] (рис. 4А). В 1995 г. обнаружен второй лиганд каннабиноид- ных рецепторов – 2-арахидонилглицерол (2-АГ) [63] (рис. 4Б). Основной биохимический путь образования анандамида начинается с N-арахидоноил фосфа- тидилэтаноламина под действием фосфолипазы D [66] (рис. 5). Деградация анандамида и других этанолами- дов жирных кислот гидролазой (fatty acid amide hydrolase) приводит к образованию АК, которая является субстратом биосинтеза эйкозаноидов [17]. Гидролиз АК-содержащих фосфолипидов (в первую очередь фосфатидилинозитола, наи- более богатого АК) фосфолипазой С приводит к образованию диацилглицерола, который в по- следующем под действием липазы метаболизиру- ется в моноацилглицерол и далее в 2-арахидоно- илглицерол [20, 63] (рис. 6). Взаимосвязь метаболических путей биосинтеза эндоканнабиноидов и эйкозаноидов Ранее считалось, что метаболизм эйкозано- идов и эндоканнабиноидов протекает незави- симо друг от друга. Это предполагало участие не связанных между собой ферментных систем. В то же время липазы, которые инициируют биосинтез как оксилипинов, так и каннабино- идов, активируются идентичными вторичными мессенджерами (например, повышением уров- ня внутриклеточного Са2+), что, вполне веро- ятно, может приводить к одновременной ини- циации образования сигнальных молекул [14, 16]. Хэмпсон и соавт. впервые продемонстриро- вали способность LOX-12 использовать в каче- стве субстрата как арахидоновую кислоту, так и анандамид [35]. Метаболизм анандамида под действием LOX-12 приводит к образованию эта- ноламида 12-гидроксиэйкозатетраеновой кис- лоты. Причем LOX-12 с одинаковой эффектив- ностью использует в качестве субстрата как АК, так и анандамид. Способность метаболизировать анандамид была выявлена и для LOX-15 [26]. Yu et al. показали способность СOX-2, но не СOX-1 окислять этаноламиды жирных кислот [67]. В экспериментах на крысах с каррагинанинду- цированным некрозом лапы установлено, что иингибирование СOX-2 приводит к накоплению анандамида. Это доказывает участие СOX-2 в окси- генации эндоканнабиноидов. Существуют данные, что преобразованные 2-AГ и анандамид в СOX-2 реакциях не являются лигандами для каннабино- идных рецепторов. Окисленные СOX-2- или LOX- эндоканнабиноиды оказывают биологическую активность через специфические рецепторы. Однако, охарактеризованы только рецепторы для простаноидных лигандов [49]. Идентифика- ция специфичных рецепторов для окисленных эндоканнабиноидов является одной из основ- ных задач в уточнении механизма их действия. В дальнейшем открытие этих рецепторов, уста- новление физиологической роли и особенности функционирования при различных патологиях, выявление специфических блокаторов рецепто- ров окисленных эндоканнабиноидных лигандов даст новые фармакологические направления и возможные пути терапевтической коррекции. Имеющиеся факты подтверждают гипотезу, что оксигенация служит механизмом для модуляции активности эндоканнабиноидной системы. Сни- жение уровня противовоспалительных эндокан- набиноидов может быть одним из механизмов, с помощью которого СOX-2 оказывает свое про- воспалительное действие. Только в 2007 г. появились первые доказатель- ства сродства анандамида и цитохрома Р450 [60]. Показана способность цитохрома Р450 семей- ства 3А и 2D6 метаболизировать анандамид. До- казательств участия цитохрома Р450 в деградации 2-АГ нет. Известно, что каннабиноиды, и в частности анандамид, стимулируют секрецию арахидоно- вой кислоты и ее метаболитов [11, 53]. Как от- мечалось выше, при гидролизе анандамида обра- зуется свободная AК, которая затем может быть преобразована в эйкозаноиды в циклооксигеназ- ных или липоксигеназных реакциях (рис. 7, путь А). Кроме того, эндоканнабиноиды могут сами подвергаться действию СOX или LOX, что также приводит к образованию эйкозаноидов (рис. 7, путь B) [40]. Следовательно, источником АК для синтеза эйкозаноидов могут быть не только АК-содержащие фосфолипиды, но и каннабино- иды. Возможно, обе реакции играют равнознач- ную роль в синтезе оксилипинов. Нами изучено дозозависимое действие синте- тических лигандов каннабиноидных рецепторов WIN 55,212-2 и анандамида на синтез эйкозано- идов – лейкотриена B4 и тромбоксана B2 клетка- ми крови в условиях in vitro [4]. Установлено, что синтетические лиганды каннабиноидных рецеп- торов дозозависимо блокируют липоксигеназ- ный путь образования провоспалительного эйко- заноида – лейкотриена В4, оказывая тем самым супрессорный эффект на активность иммунной системы. В низких концентрациях 0,1 и 1,0 мкМ WIN 55,212-2 и анандамид не влияли на уровень секреции лейкотриена B4. Под действием WIN 55,212-2 и анандамида в дозе 3,0 мкМ наблю- далось снижение уровня лейкотриена B4. Наи- большее ингибирующее влияние синтетических лигандов каннабиноидных рецепторов на выра- ботку клетками крови провоспалительного ок- силипина выявлено в концентрации 10,0 мкМ. Так, продукция лейкотриена B4 под действи- ем WIN55,212-2 в дозе 10,0 мкМ была снижена на 83% (p < 0,001), под влиянием анандамида – на 67% (p < 0,001). Следовательно, WIN55,212-2 в дозе 10,0 мкМ в большей степени ингибирует синтез лейкотриена B4 клетками крови по срав- нению с анандамидом. При этом WIN 55,212-2 и анандамид не влияли на синтез клетками крови тромбоксана B2. Полученные в эксперименте данные свидетельствуют, что синтетические каннабинои- ды способны тормозить липоксигеназный путь биосинтеза эйкозаноидов, в результате чего угнетается образование провоспалительного медиатора – лейкотриена В4. Тогда как син- тез тромбоксана, по-видимому, осуществляется по механизмам, не затрагивающим эндоканна- биноидную систему. В работах S. Diaz [21] показана способность синтетического каннабиноида (Ä9-тетрагидроканнабинол) активировать мета- болизм арахидоновой кислоты по липоксигеназ- ному пути. Этот эффект реализуется только при достаточно высоких концентрациях эндокан- набиноидных веществ (32 мкМ), что в физио- логических условиях осуществить нереально. Противоречивые данные о влиянии эндоканна- биноидов на метаболизм жирных кислот и син- тез эйкозаноидов обусловлены различием в ис- пользуемых дозах синтетических каннабиноидов и в их химическом строении. Кроме того, эффект действия синтетических лигандов каннабиноид- ных рецепторов на синтез провоспалительных медиаторов имеет ярко выраженный дозозависи- мый характер. Данные исследования доказывают способность эндоканнабиноидной системы регу- лировать активность синтеза провоспалительных оксилипинов. Очевидная взаимосвязь ферментативных путей биосинтеза метаболитов арахидоновой кислоты дает основание предположить о перекрестности их биологических функций. Роль метаболитов арахидоновой кислоты в им- мунных процессах В отличие от каннабиноидов биологические эффекты эйкозаноидов были открыты одновре- менно с установлением их структуры. Известно, что эйкозаноиды служат вторичными мессен- джерами гидрофильных гормонов, контролиру- ют сокращение гладкомышечной ткани (крове- носных сосудов, бронхов, матки), принимают участие в высвобождении продуктов внутрикле- точного синтеза (гормонов, мукоидов), оказы- вают влияние на метаболизм костной ткани, периферическую нервную систему, иммунную систему, передвижение и агрегацию клеток (лей- коцитов и тромбоцитов), являются эффективны- ми лигандами болевых рецепторов. Эйкозаноиды действуют как локальные биорегуляторы на син- тезирующие их клетки (аутокринное действие) и на соседние клетки (паракринное действие) путем связывания с мембранными рецепторами. В некоторых случаях их действие опосредовано цАМФ и цГМФ [57, 61, 64]. В условиях патологии количество эйкоза- ноидов резко возрастает [64]. При хронических воспалительных заболеваниях, таких как брон- хиальная астма, ревматоидный артрит, неспеци- фический язвенный колит, псориаз, экзема и др., лейкоциты, находящиеся в очаге воспаления, в большом количестве экспрессируют разно- образные ферменты, в том числе и фосфолипазу А2. Это приводит к освобождению АК, быстро метаболизирующейся в эйкозаноиды. Эйкоза- ноиды, в свою очередь, вызывают увеличение проницаемости сосудистой стенки, экссудацию жидкой части крови в межклеточное простран- ство и отек тканей, увеличение притока крови и гиперемию тканей, повышение температуры, усиление миграции лейкоцитов в очаг воспа- ления, что влечет еще большее высвобождение фосфолипазы А2 и дальнейшее поддержание воспаления. Эйкозаноиды играют важную роль в разви- тии неспецифической системной воспалитель- ной реакции [31]. Так, лейкотриены являются медиаторами аллергических и воспалительных процессов и синтезируются непосредственно лейкоцитами. Повышенный синтез лейкотрие- нов в основном происходит при аллергических реакциях немедленного типа и начинается по- сле связывания антигена с IgE, фиксированного на поверхности этих клеток [22, 27]. Биологиче- ское действие лейкотриена В4 опосредуется через B-LT-рецептор [27]. Первым продуктом окисления арахидоновой кислоты по циклоксигеназному пути, который играет ключевую роль в аллергических реакциях немедленного типа и воспалении, является про- стагландин D2 [65]. Он образуется в основном в тучных клетках. Появление простагландина D2 в сыворотке свидетельствует о дегрануляции и развитии ранней фазы аллергической реакции немедленного типа. Внутрикожное введение PGD2 вызывает расширение сосудов и повыше- ние их проницаемости, что приводит к стойкой гиперемии и образованию волдыря, а также к вы- ходу лейкоцитов, лимфоцитов и моноцитов из со- судистого русла [60]. Ингаляция простагландина PGD2 вызывает бронхоспазм, что свидетельству- ет о важной роли этого метаболита арахидоновой кислоты в патогенезе анафилактических реакций и системного мастоцитоза. Биологические функции эндоканнабиноидов также очень разнообразны. Эндоканнабиноиды регулируют вегетативную нервную, эндокрин- ную, половую, иммунную системы, участвуют в координации движений, поддержании посто- янной температуры тела, формировании процес- сов памяти и аппетита [1, 8-10, 25, 34, 36, 52, 54]. Подавление иммунного ответа природными каннабиноидами было показано в ряде исследо- ваний [21, 24]. Каннабиноиды снижают общую сопротивляемость к бактериальным и вирусным инфекциям, пролиферацию лимфоцитов, синтез антител, активность клеток-киллеров и макро- фагов. На молекулярном уровне эти эффекты объясняются снижением синтеза интерферона, фактора некроза опухоли-a (TNFa), интерлей- кина (IL-2) [38, 39]. Rockwell и др. показали, что 2-AГ, анандамид подавляют секрецию IL-2 в ак- тивированных Т-клетках. В то же время было по- казано, что природные каннабиноиды вызывают увеличение, а не уменьшение супернатантной IL-1 активности и увеличение пролиферации В-лимфоцитов [40]. Все эти данные предполага- ют сложный характер модуляции иммунного от- вета каннабиноидами. Лиганды каннабиноидных CB2-рецепторов ингибируют сигнальный путь, запускающий ак- тивацию комплекса toll-like рецепторов CD14/ TLR4 /MD2, стимуляциякоторых приводиткэкс- прессии провоспалительных цитокинов (IL-1b, IL-6, IL-8 и TNFa) и детерминации Th1 иммун- ного ответа [56]. В исследованиях in vitro по изучению влия- ния синтетических лигандов каннабиноидных рецепторов WIN 55,212-2 и анандамида на син- тез цитокинов иммунокомпетентными клетками [2, 3, 5] нами было выявлено, что каннабиноиды ингибируют способность иммунных клеток экс- прессировать IL-2, IL-8, TNFa. Выявленные эф- фекты свидетельствуют об иммуномодулирую- щей способности каннабиноидов. В то же время остался открытым вопрос по какому механизму осуществляется регуляция иммунной системы – через непосредственное влияние каннабинои- дов на синтез провоспалительных медиаторов или опосредованно через каннабиноидные СВ- рецепторы? Поскольку известно, что многие свои эффекты каннабиноиды реализуют по ре- цептор-независимому пути [15]. Как отмечалось выше эндоканнабиноидная система включает два основных типа рецеп- торов – СВ1-рецепторы, которые преимуще- ственно экспрессируются в области головного и спинного мозга, отвечают за двигательные и когнитивные функции, и каннабиноидные СВ2-рецепторы [18, 45]. По литературным дан- ным известно, что СВ2-рецепторы в основном локализуются на мембранах иммунокомпе- тентных клетках, где они опосредуют иммуно- регуляторный эффект [28]. Нашими исследо- ваниями также показано, что СВ2-рецепторы локализуются на иммунных клетках, тогда как СВ1-рецепторы не были идентифициро- ваны на клетках иммунной системы. Цитоме- трический анализ СВ2-рецептора на иммуно- компетентных клетках показал, что в норме содержание СВ2-рецептора не менее 90% [6]. Были смоделированы условия активации иммунной системы для установления роли СВ2-рецептора в регуляции иммунного ответа. Стимуляция иммунной системы in vivo осущест- влялась интракорпоральным облучением крови и обогащением крови озоно-кислородной сме- сью. Индуцирование клеток иммунной систе- мы in vivo путем интракорпорального облучения крови привело к снижению количества клеток, имеющих СВ2-рецепторы до 60% [6]. После вве- дения внутривенно озоно-кислородной смеси количество клеток, содержащих СВ2-рецептор, снизилось до 70%. То есть при активации иммун- ной системы происходит снижение числа клеток, экспрессирующих эндоканнабиноидный СВ2- рецептор. Снижение экспрессии СВ2-рецептора на иммунных клетках может быть опосредовано их блокадой эндогенными синтезированными de novo каннабиноидами, в результате чего за- пускается программа лимитирования функции каннабиноидной системы и тем самым активи- руется иммунная система. В то время как в усло- виях нормы повышенная экспрессия каннабино- идного СВ2-рецептора приводит к сохранению физиологического баланса между синтезом про- и противовоспалительных медиаторов. Сово- купность полученных результатов исследования позволяет заключить, что блокада экспрессии СВ2-рецептора при формировании иммунного ответа является важным механизмом регуляции воспалительного процесса. Доказана реципрок- ная взаимосвязь между активностью иммунной и эндоканнабиноидной системами. Новые дан ные о роли эндоканнабиноидной системы в ре- гуляции иммунного ответа вносят существенный вклад в изучение клеточно-молекулярных меха- низмов развития воспалительной реакции. Заключение Таким образом, метаболиты арахидоновой кислоты являются важным звеном, участвующим в регуляторных механизмах иммунометаболи- ческого ответа клетки и опосредующим интен- сивность воспалительных процессов. Взаимо- связь между метаболизмом эндоканнабиноидов и эйкозаноидов предполагает перекрестность выполняемых ими функций и взаиморегуля- цию. Дальнейшие исследования в этом направ- лении расширят понимание клеточно-молеку- лярных механизмов сигнальной коммуникации и межсистемной интеграции компонентов эндо- каннабиноидной и эйкозаноидной систем, по- зволят разработать инновационные технологии управления их функционированием. Список литературы 1. Крылатов А.В., Ужаченко Р.В., Маслов Л.Н., Угдыжекова Д.С. Анандамид и R-(+)метанандамид предупреждают развитие ишемических и реперфузионных аритмий у крыс посредством стимуляции СВ2-рецепторов // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2002. – № 3. – С. 6-9. 2. Лобанова [Исаченко] Е.Г., Виткина Т.И., Бердышев Е.В. Влияние лигандов каннабиноидных ре- цепторов WIN 55,212-2 и анандамида на выработку TNF-a и ИЛ-8 лейкоцитами крови здоровых лиц и больных с аллергопатологией // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2003. – № 2. – С. 86-91. 3. Лобанова Е.Г. Влияние лигандов каннабиноидных рецепторов на реактивность иммунокомпетент- ных клеток. – Изд. Lambert Academic Publishing (Германия). – 2011. – 128 с. 4. Лобанова Е.Г. Влияние синтетических лигандов каннабиноидных рецепторов на экспрессию эйко- заноидов in vitro // Бюллетень СО РАМН. – 2012. – Т. 32, № 2. – С. 5-8. 5. Лобанова Е.Г. Действие синтетических лигандов каннабиноидных рецепторов на реактивность им- мунокомпетентных клеток in vitro // Медицинская иммунология. – 2009. – Т. 11, № 2-3. – С. 261-264. 6. Лобанова Е.Г. Роль эндоканнабиноидных рецепторов в регуляции иммунного ответа // Медицин- ская иммунология. – 2012. – Т. 14, № 3. – С. 189-194. 7. Сергеева М.Г., Варфоломеева А.Т. Каскад арахидоновой кислоты. – М.: Народное образование, 2006. – 256 с. 8. Чурюканов М.В., Чурюканов В.В. Функциональная организация и терапевтический потенциал эн- догенной каннабиноидной системы // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2004. – № 67 (2). – С. 70-78. Каннабидиол (КБД, CBD) - не психоактивен, обладает антиконвульсивным действием, препятствует развитию панических реакций. Каннабинол ( КБН, CBN) - продукт окисления ТГК, его действие примерно в 10 раз слабее. Поделиться сообщением Ссылка на сообщение Поделиться на других сайтах
lll 286 Опубликовано: 10 августа, 2018 Модуляторы эндогенной каннабиноидной системы как нейропротекторы. Е.Е. Генрихс, М.Ю. Бобров, Е.Л. Андрианова, Н.М. Грецкая, А.А. Лыжин, А.В. Блаженова, Л.Е. Фрумкина, В.В. Безуглов, Л.Г. Хаспеков Научный центр неврологии РАМН; Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва) Исследовано защитное действие эндоканнабиноида N-арахидоноилдофамина (АДА) в модели апоптоза, индуцированного в культивируемых нейро- нах мозжечка крысы путем снижения концентрации ионов калия в питательной среде. Показано, что АДА оказывает дозозависимый нейропро- текторный эффект. Максимальная выживаемость нейронов, определяемая с помощью МТТ-теста, наблюдалась при концентрации АДА 10 мкМ и составляла 65%. Проведена оценка эффективности использования АДА совместно с ингибитором гидролазы амидов жирных кислот N-эйкоза- пентаеноилсеротонином (ЭС). Сочетание АДА в субмаксимальной концентрации (5 мкМ) с ЭС (10 мкМ) значительно усиливало защитный эффект, повышая показатель выживаемости нейронов до 78%. Полученные данные свидетельствуют, что применение АДА совместно с ингиби- тором фермента его метаболизма позволяет снизить концентрацию нейропротектора, что, наряду с усилением защитного эффекта АДА, спо- собствует уменьшению его возможного побочного действия. Таким образом, сочетанное применение модуляторов эндоканнабиноидной системы — агонистов каннабиноидных рецепторов и ингибиторов метаболизма каннабиноидов — представляется эффективным для защиты нервных клеток от апоптоза. Новая группа ацилдофаминов – N-ацилдофами- ны – была обнаружена в нервной ткани животных сравнительно недавно [17, 12, 13]. Среди этих соединений наиболее активно изу- чается N-арахидоноилдофамин (АДА). Кнастоящему времени показано, что АДА является лиган- дом каннабиноидного рецептора 1-го типа [8], а также ванилоидного рецептора 1-го типа [17], в связи с чем АДА считают компонентом эндоканнабиноидной системы. Основными функциональными звеньями эндогенной кан- набиноидной системы (ЭКС), играющей важную физио- логическую роль в регуляции работы головного мозга, являются каннабиноидные рецепторы (КР), их эндоген- ные лиганды, или эндоканнабиноиды, и внутриклеточные ферменты, участвующие в синтезе и утилизации эндокан- набиноидов [5]. К настоящему времени клонированы два типа – КР–КР1 и КР2, которые присутствуют во многих структурах нервной системы [18], а также в других тканях, например, на клетках иммунной системы [19]. Эндоканнабиноиды (ЭК) представляют собой амидные и эфирные производные арахидоновой и ряда других жир- ных кислот. Наиболее изучаемыми ЭК являются N-арахи- доноилэтаноламин (анандамид), 2-арахидоноилглицерин, N-арахидоноилглицин и N-арахидоноилдофамин (рис. 1). Важным свойством ЭКС является регуляция синаптиче- ской передачи. Эндоканнабиноиды, синтезируемые постсинаптическим нейроном в ответ на афферентную стимуляцию, высвобождаются из него и взаимодействуют с КР, локализованными на аксонных терминалях преси- наптического нейрона, что приводит к торможению выброса нейромедиатора. Это свойство ЭКС может иметь большое значение для восстановления нормальной работы центральных синапсов и поддержания жизнеспособности нейронов в условиях патологии, связанной с нарушениями регуляции их нейромедиаторной функции [5]. Нейропротекторное действие анандамида и 2-АГ при моделировании различных форм патологии головного мозга было продемонстрировано рядом авторов [10, 20, 21, 22]. Однако защитный эффект АДА практически не изу- чался. В данной работе проводилась оценка защитного действия АДА в модели нейронального апоптоза, индуци- рованного в культуре нейронов мозжечка крысы путем снижения содержания ионов калия в инкубационной среде (К+ -депривация). Серьезным затруднением в реализации защитного дей- ствия ЭК является их относительно быстрый гидролиз в клетках и тканях [23]. Поэтому мы предположили, что применение ингибиторов гидролиза ЭК даст возможность усилить нейропротекторное действие и, возможно, снизит их эффективную концентрацию. Ранее нами было показа- но, что N-арахидоноилсеротонин (АС) является ингибито- ром основного фермента метаболизма ЭК — гидролазы амидов жирных кислот (ГАЖК) [9]. В данной работе были синтезированы аналоги АС и проверены их ингибиторные свойства. Также на модели нейронального апоптоза были исследованы защитные свойства двухкомпонентных систем, в которых первым компонентом является АДА, а вторым — ингибитор ГАЖК. Материалы и методы Реактивы. N-арахидоноилэтаноламин (анандамид), амиды жирных кислот с дофамином и серотонином были синтезированы и охарактеризованы по методикам, опи- санным авторами ранее [1, 7]. Были синтезированы амиды арахидоновой (С20:4, w6) кислоты с дофамином, серото- нином, триптамином, бромтриптамином и метокситрип- тамином. Также были получены амиды эйкозапентаено- вой (С20:5, w3), линоленовой (С18:3, w6), нонановой (С9) кислот с серотонином. Меченый тритием по этаноламину N-арахидоноилэтано- ламин был синтезирован в Институте молекулярной гене- тики РАН. Удельная радиоактивность [3Н]-анандамида составила 20 Ки/ммоль. Среды и добавки для культивирования клеток (среда Игла, сыворотка новорожденных телят (FBS), глутамин, смесь пенициллина и стрептомицина, раствор трипсина, раствор Версена, раствор HEPES, таблетки фосфатно-солевого буфера (PBS), МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5- дифенилтетразолий-бромид) были приобретены в фирме «ПанЭко» (Россия). Получение мембранного препарата из мозга крысы. Все про- цедуры проводили при температуре +4° С. Головной мозг крысы измельчали и гомогенизировали в десятикратном объеме буфера (Tris 50 мM, рН 7,4). Для получения мем- бранной фракции гомогенат центрифугировали 10 мин при 1000 g, надосадочную жидкость отбирали и центрифу- гировали 25 мин при 12 000 g. Супернатант удаляли, осадок растворяли в буфере, делили на порции и замораживали в жидком азоте. Содержание белка в мембранном препарате определяли по методу Лоури. Гидролиз анандамида. Во всех экспериментах раствор мем- бран в буфере Tris-HCl (50 мМ, рН 7,4) предварительно инкубировали при 37° С в течение 5 мин. Растворы субстра- та и ингибиторов в этаноле вносили таким образом, чтобы конечная концентрация этанола составила 5%. Спиртовой раствор субстрата готовили в виде смеси радиоактивного и немеченного анандамида в соотношении 1 : 10. После вне- сения веществ в препарат мембран смесь перемешивали и инкубировали при 37° С. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты (50–100 мкл). Реакцию оста- навливали на льду добавлением равного объема суспензии активированного угля в 0,5 М-соляной кислоте (1 : 5), остав- ляли на 25 мин при комнатной температуре при постоянном перемешивании, далее центрифугировали 5 мин при 1800 g. Порцию надосадка отбирали, радиоактивность измеряли с помощью сцинтилляционного счета. В качестве контроля использовали раствор, не содержащий мембран. Для определения временной зависимости гидролиза время инкубации устанавливали 60–90 мин. Для определения зависимости скорости гидролиза от концентрации белка в препарате применяли реакционную смесь, содержащую 5–200 мкг/мл белка (восемь концентраций) и 2 мкМ [3Н]- анандамида, время инкубации — 30 мин. Для определения зависимости скорости гидролиза от концентрации суб- страта использовали реакционная смесь, содержащую 40 мкг/мл белка и 0,78–25 мкМ анандамида. Время инку- бации — 30 мин. Для определения константы Михаэлиса и максимальной скорости гидролиза использовали построения в линеари- зации Корниш–Боуден. Для определения констант ингибирования для каждого соединения использовали четыре двукратных разведения субстрата и потенциального ингибитора. Инкубационная смесь (100 мкл) содержала 40 мкг/мл белка, анандамид (0,75–7 мкМ) и тестируемые соединения в диапозоне кон- центраций 0,5–50 мкМ. Инкубировали 5 мин, отбирали порцию 50 мкл останавливали реакцию на льду добавлени- ем суспензии активированного угля. После центрифугиро- вания определяли радиоактивность методом сцинтилля- ционного счета. Культивирование клеток мозжечка. Для культивирования клеток по описаной ранее методике [6] использовали мозжечок семи- и восьмидневных крыс. После механи- ческой и ферментативной диссоциации ткани мозжечка получали клеточную суспензию в среде Игла. Среда содержала 25 мM KCl, 2 мМ глутамина, 10% инактивиро- ванной нагреванием FBS. Клетки вносили в 24-луноч- ный планшет по 500 мкл суспензии на лунку из расчета 2,5 ´ 105 клеток на 1 см2. Дно лунок предварительно покрывали 0,05-процентным раствором полиэтиленэми- на. Культивирование проводили при 35° С в воздушной атмосфере с содержанием СО2 5%. Культуры нейронов использовали на седьмой-восьмой день инкубации. Исследование выживаемости нейронов. Нейрональный апоптоз индуцировали снижением содержания К+ в инку- бационной среде [14]. Для этого исходную среду культиви- рования отбирали из лунок, оставляя в каждой по 200 мкл. Отобранную среду разбавляли стандартной средой Игла, содержащей 5 мМ К+, без сыворотки. Полученная инкуба- ционная среда (ИС) содержала 9 мМ К+ и 2% сыворотки и использовалась для приготовления растворов исследуемых соединений. Исходные растворы (250´) разных концент- раций соединений готовили разведением в этаноле. Конечные растворы готовили добавлением одинаковых объемов исходных растворов к одинаковым объемам ИС. Для контролей использовали ИС с содержанием К+ 9 мМ или 25 мМ, а вместо соединений добавляли соответствую- щие объемы этанола. Таким образом, содержание раство- рителя оставалось одинаковым во всех ИС. Далее оставшуюся в лунках среду культивации удаляли и добавляли контрольные ИС и растворы соединений. Клетки культивировали в СО2-инкубаторе при стандарт- ных условиях в течение 18 часов. Анализ выживаемости проводили при помощи МТТ- теста. Для этого ИС отбирали, вносили в лунки раствор МТТ (0,45 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере и инкуби- ровали 30–40 мин. Затем раствор МТТ удаляли и добав- ляли в лунки ДМСО. После растворения образовавшего-ся из МТТ формазана измеряли оптическую плотность при длине волны 570 и 620 нм. Относительную оптиче- скую плотность (А) вычисляли по формуле А570–А620. Расчет относительной жизнеспособности производили по формуле В указанных условиях эксперимента при понижении кон- центрации ионов калия в негативном контроле (К+ – 9 мМ) в среднем наблюдалось выживание 50% клеток, по сравне- нию с положительным контролем (К+ – 25 мМ). Статистический анализ. При анализе полученных результа- тов использовали описательные методы статистики (опре- деление средних значений и стандартного отклонения). Достоверность различий оценивали с помощью t-теста Стьюдента или однофакторного дисперсионного анализа с применением апостериорных тестов. Статистически значимыми считали результаты при р <0,05. Результаты и обсуждение Ингибиторы ГАЖК. Ингибиторные свойства синтезирован- ных соединений изучали в препарате мембран головного мозга крысы. Были определены параметры гидролиза анан- дамида в используемой тест-системе. Зависимость скорости гидролиза от концентрации субстрата оставалась линейной в диапазоне концентраций 1–5 мкМ при концентрации белка в препарате 20–50 мкг/мл. Начальную скорость гид- ролиза определяли в течение первых 10–15 мин инкубации. Кажущаяся константа Михаэлиса (Км) в данных условиях составила 3,86 ± 0,84 мкМ, что согласуется с данными дру- гих исследований [16]. Ранее было установлено, что N-арахидоноил-5-гидро- кситриптамин (N-арахидоноилсеротонин, АС), является селективным ингибитором ГАЖК [9, 15]. В данной рабо- те были синтезированы аналоги АС с отличиями в ацильной части молекулы, а также с модификациями в структуре серотонина. Анализ ингибирования гидролиза анандамида N-арахидоноилсеротонином и его аналога- ми показал, что все тестируемые соединения тормозят гидролиз анандамида в концентрациях до 50 мкМ. Наиболее активным соединением по сравнению с АС оказался N-эйкозапентаеноилсеротонин (ЭС). Аналоги с линоленовой и нонановой кислотами оказались замет- но менее активными (табл. 1). Замена 5-гидроксотриптамина на триптамин приводила к снижению ингибиторной активности в 1,4 раза, метили- рование гидроксогруппы практически не влияло на инги- бирование. Бромирование триптамина по пятому поло- жению приводило к ослаблению ингибирования в 7,5 раз. Интересно, что арахидоноил триптофан не ингибировал гидролиз анандамида. Поэтому для дальнейших исследо- ваний был выбран ЭС как наиболее эффективный инги- битор ГАЖК. Защитное действие нейролипинов. В предварительных экспериментах было показано, что АДА (10 мкМ) не ока- зывал токсического действия на нейроны в нормальных условиях. Ингибиторы ГАЖК (АС и ЭС) в концентрации 10 мкМ также не оказывали токсического действия в нормальных условиях и не проявляли самостоятельного защитного эффекта в условиях К+-депривации (данные не приведены). Было установлено, что АДА оказывет дозозависимое защит- ное действие в диапазоне концентраций до 0,1–10 мкМ (рис. 2). Максимальный защитный эффект наблюдался при концентрации АДА 10 мкМ и составил 65% выживших нейронов. Первичная оценка эффективности комбинации АДА с ингибитором гидролиза показала, что введение ЭС (10 мкМ) в качестве второго компонента достоверно усиливает защитные свойства АДА, взятого в субмаксимальной концентра- ции 5 мкМ. Использование АС (10 мкМ) в качестве второго компонента комплекса не приводило к выраженному усиле-нию защитного эффекта, что, возможно, связано с меньшей активностью АС в отношении ГАЖК (рис. 3). Далее была проведена оценка зависимости защитного дей- ствия АДА (5 мкМ) от концентрации ЭС. Заметное повы- шение жизнеспособности нейронов (на 28%) наблюдалось для комбинации АДА с 5 мкМ ЭС. Максимальное нейро- протекторное действие для комплекса АДА+ЭС составило 78% и регистрировалось при концентрации ЭС 10 мкМ (рис. 4). Таким образом, использование субмаксимальной концент- рации АДА (5 мкМ) в сочетании с ЭС (10 мкМ) приводит к значительному усилению защитного эффекта. Значения выживаемости для данной комбинации превышают подоб- ные значения для АДА в концентрации 10 мкМ. Важно отметить, что ЭС не оказывает собственного защитного действия и не токсичен в нормальных условиях в концент- рации (10 мкМ), использованной в данной работе. Можно заключить, что данная комбинация нейролипинов позво- ляет снизить концентрацию нейропротектора и уменьшить возможные побочные эффекты без снижения его эффек- тивности. Ранее нами было показано, что N-ацилдофамины являют- ся антиоксидантами и защищают нейроны в условиях окислительного стресса in vitro [2, 11]. В работе по изуче- нию влияния N-ацилдофаминов на мозговую микроцир- куляцию было установлено, что они способны усиливать локальный кровоток в тканях головного мозга крыс, а также оказывают антиагрегационное действие [3]. Кроме того, N-ацилсеротонины, помимо их ингибиторных свойств в отношении ГАЖК, способны эффективно бло- кировать агрегацию тромбоцитов человека, стимулирован- ную арахидоновой кислотой, АДФ и адреналином [4]. Приведенные данные публикаций указывают на то, что нейролипины могут выступать как нейропротекторы на разных этапах развития ишемических повреждений голов- ного мозга. Таким образом, совместное применение модуляторов кан- набиноидной системы — агонистов рецепторов и ингиби- торов ферментов метаболизма этих агонистов — представ- ляется эффективным для защиты нервных клеток. Результаты работы могут послужить экспериментальным обоснованием возможности практического применения исследованных соединений в целях фармакологической коррекции повреждений нейронов головного мозга в пато- логических условиях, таких как ишемический инсульт. Список литературы 1. Безуглов В.В., Грецкая Н.М., Блаженова А.В. и др. Арахидоноиламинокислоты и арахидоноилпептиды: синтез и свойства. Биоорган. химия 2006; 32: 258–267. 2. Бобров М.Ю., Лыжин А.А., Андрианова Е.Л. и др. Антиоксидантные и нейропротекторные свойства N-докозагек- саеноилдофамина. Бюл. эксп. биол. мед. 2006; 142: 406–408. 3. Васильева Т.М., Петрухина Г.Н., Макаров В. А. и др. Влияние дофаминамидов полиненасыщенных жирных кислот на сверты- вающую систему крови и мозговое кровообращение. Эксп. клин. фармакол. 2002; 65: 41–45. 1. Васильева Т.М., Петрухина Г.Н., Макаров В.А. и др. Действие ряда синтетических амидов арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот на тромбоцитарную агрегацию. Пробл. гематологии и переливания крови 2005; 2: 15–21. 2. Хаспеков Л. Г., Бобров М. Ю. Эндогенная каннабиноидная система и ее защитная роль при ишемическом и цитотоксическом повреждении нейронов головного мозга. Нейрохимия 2006; 23: 85–105. 3. Andreeva N., Khodorov B., Stelmashook E. et al. Inhibition of Na+/Ca2+ exchange enhances delayed neuronal death elicited by glu- tamate in cerebellar granule cell cultures. Brain Res. 1991; 548: 322–325. 1. Bezuglov V., Bobrov M., Gretskaya N. et al. Synthesis and biological evaluation of novel amides of polyunsaturated fatty acids with dopamine. Bioorgan. Med. Chem. Lett. 2001; 11: 447–449. 2. Bisogno T., Melck D., Bobrov M.Yu. et al. N-acyl-dopamines: novel synthetic CB(1) cannabinoid-receptor ligands and inhibitors of anan- damide inactivation with cannabimimetic activity in vitro and in vivo. Biochem. J. 2000; 351: 817–824. 3. Bisogno T., Melck D., De Petrocellis L. Arachidonoylserotonin and other novel inhibitors of fatty acid amide hydrolase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998; 248: 515–522. 4. Bobrov M., Gretskaya N., Payet O. et al. Different pharmacological profile of two closely related endocannabinoid ester analogs. Life Sci. 2005; 77: 1425–1440. 5. Bobrov M.Y., Lizhin A.A., Andrianova E.L. et al. Antioxidant and neuroprotective properties of N-arachidonoyldopamine. Neurosci. Lett. 2008; 431: 6–11. 6. Chu C.J., Huang S.M., De Petrocellis L. et al. N-oleoyldopamine, a novel endogenous capsaicin-like lipid that produces hyperalgesia. J. Biol. Chem. 2003; 278: 13633–13639. 7. De Petrocellis L., Chu C.J., Moriello A.S. et al. Actions of two natu- rally occurring saturated N-acyldopamines on transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) channels. Br. J. Pharmacol. 2004; 143: 251–256. 8. D'Mello S.R , Galli C., Ciotti T. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 10989–10993. 9. Fowler C.J., Tiger G., Lуpez-Rodrнguez M.L. et al. Inhibition of fatty acid amidohydrolase, the enzyme responsible for the metabolism of the endocannabinoid anandamide, by analogues of arachidonoyl-sero- tonin. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2003; 18: 225–231. 10. Hillard C.J., Wilkison D.M., Edgemond W.S. et al. Characterization of the kinetics and distribution of N-arachidonylethanolamine (anan- damide) hydrolysis by rat brain. Biochim. Biophys. Acta. 1995; 1257: 249–256. 11. Huang S.M., Bisogno T., Trevisani M. et al. An endogenous cap- saicin-like substance with high potency at recombinant and native vanilloid VR1 receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 8400–8405. 12. Mackie K. Distribution of cannabinoid receptors in the central and peripheral nervous system. Handb. Exp. Pharmacol. 2005; 168: 299–326. 13. Pandey R, Mousawy K, Nagarkatti M. et al. Endocannabinoids and immune regulation. Pharmacol. Res. 2009; 60: 85–92. 14. Panikashvili D., Simeonidou C., Ben-Shabat S. et al. An endogenous cannabinoid (2-AG) is neuroprotective after brain injury. Nature 2001; 413: 527–531. 15. Schomacher M., Mьller H.D., Sommer C. et al. Endocannabinoids mediate neuroprotection after transient focal cerebral ischemia. Brain Res. 2008; 1240: 213–220. 16. Sinor A.D., Irvin S.M., Greenberg D.A. Endocannabinoids protect cerebral cortical neurons from in vitro ischemia in rats. Neurosci. Lett. 2000; 278: 157–160. 17. Yates M.L., Barker E.L. Inactivation and biotransformation of the endogenous cannabinoids anandamide and 2-arachidonoylglycerol. Mol. Pharmacol. 2009; 76: 11–17. Каннабидиол (КБД, CBD) - не психоактивен, обладает антиконвульсивным действием, препятствует развитию панических реакций. Каннабинол ( КБН, CBN) - продукт окисления ТГК, его действие примерно в 10 раз слабее. Поделиться сообщением Ссылка на сообщение Поделиться на других сайтах
lll 286 Опубликовано: 10 августа, 2018 РОЛЬ ЭНДОКАННАБИНОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА Лобанова Е.Г. Владивостокский филиал Учреждения РАМН Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН – Научно-исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения, г. Владивосток Резюме. Изучена экспрессия эндоканнабиноидных рецепторов (СВ1, СВ2) на иммунокомпетент- ных клетках при стимуляции иммунной системы in vivo. Для стимуляции иммунной системы ис- пользовали интракорпоральное облучение крови и обогащение крови озоно-кислородной смесью. Установлено, что в норме содержание мононуклеарных лейкоцитов (МЛ), экспрессирующих на сво- ей поверхности дифференцирующий антиген к рецептору СВ2, составило более 90%. Мононуклеар- ных лейкоцитов, имеющих дифференцирующий антиген к рецептору СВ1, не выявлено. Стимуляция иммунной системы in vivo приводит к подавлению экспрессии эндоканнабиноидного СВ2-рецептора на поверхности МЛ, что является прямым доказательством участия эндоканнабиноидной системы в регуляции иммунного ответа. Введение В последние годы достигнут большой прогресс в изучении физиологической роли и механизмов функционирования в организме эндоканнабино- идной системы (ЭКС) [9, 10]. Эндоканнабино- идная система является эндогенной сигнальной системой, принимающей участие в поддержании энергетического, метаболического, иммунного баланса организма. Эндоканнабиноидная систе- ма включает в себя G-протеин (удвоенный), кан- набиноидные рецепторы 1 и 2 типов, эндоканнабиноиды и энзимы, ответственные за их синтез и разрушение [15, 17]. Показано, что рецепторы 1 типа (СВ1) преимущественно экспрессируют в области головного и спинного мозга, отвечают за двигательные и когнитивные функции, раз- витие положительных эмоциональных реакций, температуру тела, сон и бодрствование и т.д. Каннабиноидные рецепторы 2 типа (СВ2) лока- лизуются главным образом в клетках иммунной системы, в связи с чем предполагается их участие в регуляции иммунных реакций [10, 12]. В настоящее время известно, что эндокан- набиноиды способны регулировать различные физиологические процессы: поддержание тонуса гладкой мускулатуры сосудов и половых орга- нов, агрегацию и адгезию тромбоцитов, сверты- ваемость крови, высвобождение биологически активных веществ – медиаторов воспаления – цитокинов, эйкозаноидов, СО, NO и т.д. Эндо- каннабиноиды участвуют в иммунном ответе: определяют выживаемость клеток, стимуляцию или подавление их роста, дифференциацию, функциональную активность иммунного ответа [13, 14]. В исследованиях, проведенных в Научно- исследовательском институте медицинской климатологии и восстановительного лечения СО РАМН (НИИ МКВЛ СО РАМН), установлена роль лигандов каннабиноидных рецепторов в регуляции иммунного ответа. Показано in vitro, что синтетические лиганды каннабиноидных ре- цепторов – WIN-55,212-2 и анандамид проявля- ют дозозависимое иммуносупрессорное действие на клетки иммунной системы через подавление экспрессии провоспалительных цитокинов [4]. В литературе встречаются сведения о том, что агонисты каннабиноидных рецепторов способ- ны подавлять выработку медиаторов воспаления, взаимодействуя с СВ2-рецепторами или блокируя их экспрессию [16]. Однако до конца не опреде- лена роль СВ2-рецепторов в регуляции иммун- ного ответа, данный вопрос остается открытым до сих пор. Цель исследования: изучить экспрессию эндоканнабиноидных рецепторов (СВ1, СВ2) на им- мунокомпетентных клетках при стимуляции им- мунной системы in vivo. Материалы и методы Работу проводили на базе лаборатории биоме- дицинских исследований (руководитель – про- фессор, д.б.н. Т.П. Новгородцева) НИИ МКВЛ СО РАМН. Исследование было одобрено эти- ческим комитетом, все добровольцы подписали форму добровольного информированного согла- сия. В исследовании принимали участие 28 здоро- вых добровольцев в возрасте 23-55 лет (32,2±8,2 лет) (из них 9 мужчин [32%] и 19 женщин [68%]). Гематологические параметры периферической крови определяли на анализаторе Абакус (Австрия). Фенотипирование лимфоцитов пери- ферической крови проводили с помощью моно- клональных антител к молекулам CD3, CD4, CD8, CD16, CD22, СD25, HLA-DR (Беларусь). Фагоцитарную активность нейтрофилов опре- деляли по методу Д.Н. Маянского и соавт [7]. Для оценки кислородзависимых механизмов бак- терицидности нейтрофилов использовали тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ), определяли НСТ-спонтанный, НСТ резерв, ин- декс активации нейтрофилов (ИАН) и резерв индекса активации нейтрофилов по методу Park в модификации У.В. Шмелева. Уровень провос- палительных цитокинов (TNFa, IL-8) определя- ли иммуноферментным методом (тест-система фирмы INVITROGEN, Бельгия). Для стимуляции иммунной системы прово- дили нагрузочные тесты in vivo. В качестве нагру- зочного теста in vivo применяли два метода им- муностимуляции: интракорпоральное облучение крови и внутривенное введение озонированного физиологического раствора. Интракорпораль- ное облучение крови проводили путем введения одноразового стерильного катетера через пунк- ционную иглу непосредственно в кровеносное русло. Облучение крови проводили однократно с помощью аппарата «Иволга – ОМС-01», ис- пользовали спектральный диапазон 650-2000 нм с экспозицией 20 мин. Озонирование физиоло- гического раствора осуществляли на аппарате «Медозон». Раствор в количестве 200 мл пред- варительно озонировали, пропуская через него озоно-кислородную смесь до достижения кон- центрации озона в жидкости – 6 мкг/мл, после чего вводили внутривенно капельно. В зависимости от метода стимуляции были сформированы две группы. В первую группы вошли лица, получавшие световую иммуности- муляцию: 15 человек (из них 6 мужчин и 9 жен- щин). Лица, получавшие озонотерапию, состави- ли вторую группу: 13 человек (из них 3 мужчин и 10 женщин). Забор периферической крови проводили дважды до облучения крови или введения озо- но-кислородной смеси и через три часа после процедур. Ранее было показано [3], что при сти- муляции in vivo увеличение концентрации про- воспалительных цитокинов в крови наступает через 3 часа. Кровь отбирали из локтевой вены в стерильные силиконизированные пробирки с антикоагулянтом (ЭДТА – 0,1М 0,02 мл/мл кро- ви; «Venoject»). Для удаления эритроцитов пробо- подготовку проводили по безотмывочной тех- нологии с использованием лизирующего 0,83% раствора NH4CL [5]. Цельную кровь разбавляли 1:10 лизирующим раствором, тщательно пере- мешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Взвесь клеток осаждали центрифуги- рованием при 600 g и температуре 20 °С. Клетки дважды отмывали средой 199. Отмытые клет- ки разводили средой RPMI-1640 (Sigma, США) до рабочей концентрации 1 × 105 кл/мл. Опреде- ление экспрессии поверхностных маркеров эн- доканнабиноидных рецепторов проводили при помощи соответствующих антител (Santa Cruz Biotechnology, США), результаты учитывали ме- тодом проточной цитофлюорометрии на проточ- ном цитометре FACSСalibur (Becton Dickinson, США). На мононуклеарных лейкоцитах (МЛ) исследовали уровень эндоканнабиноидных рецепторов (СВ1, СВ2). Гейт (окно) популяции кле- ток устанавливали на основе комбинации прямо- го и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 10 000 кле- ток в гейте. Статистическая обработка материа- ла проведена при помощи программного пакета WinMDI 2,8. Результаты и обсуждение Для выявления иммуностимулирующих свойств физических методов была проведена оценка иммунологических и гематологических параметров периферической крови у здоровых доноров до и после воздействия интракорпораль- ным облучением крови и внутривенным введени- ем озонированного физиологического раствора. Выявлено повышение уровня провоспалитель- ных цитокинов, количества клеток белой крови и фагоцитирующих нейтрофилов (табл. 1). Сле- довательно, общая направленность изменений иммунологических показателей характеризова- лась повышением эффективности защитных ре- акций. Проведенный цитометрический анализ мо- нонуклеарных лейкоцитов здоровых доноров показал, что процентное содержание клеток, экспрессирующих на своей поверхности диффе- ренцирующий антиген к рецептору СВ2, состави- ло более 90% от всех исследуемых клеток (рис. 1). Число МЛ, имеющих дифференцирующий анти- ген к рецептору СВ1,не выявлено (рис. 1). Данный факт подтверждают литературные данные о том, что эндоканнабиноидный рецептор СВ2 экспрес- сируется на поверхность МЛ, а эндоканнабино- идный рецептор СВ1 – нет [12]. Следовательно, наличие эндоканнабиноидных СВ2-рецепторов на МЛ является маркером лейкоцитарного пула клеток. Ранее нами выявлено, что синтетические ли- гандыканнабиноидныхрецепторов(WIN55,212-2 и анандамид) модулируют сигнальную функцию клеток иммунной системы через эндоканнаби- ноидный рецептор СВ2, подавляющий выработ- ку провоспалительных цитокинов (IL-2, IL-8, TNFa) [4, 11]. Возможно, что интенсивность им- мунного ответа опосредована через активность экспрессии эндоканнабиноидного рецептора СВ2. Отсутствие данных об особенностях выра- ботки СВ2-рецептора при различных состояниях иммунного ответа побудила нас изучить актив- ность экспрессии СВ2-рецептора на иммуноком- петентных клетках в норме и при стимуляции иммунной системы нагрузочными тестами in vivo физическими методами. Из совокупности современных методов, сти- мулирующих иммунный ответ, было выбрано два физических метода: интракорпоральное облуче- ние крови и обогащение крови озоно-кислород- ной смесью. По данным литературы [6, 8] и ран- ним исследованиям НИИ МКВЛ СО РАМН [1], оба метода влияют на изменение секреции цито- кинов, активность клеток эндотелия микрососу- дов, сосудистых макрофагов, внутрисосудистыхлейкоцитов и тромбоцитов, различных стромальных клеток в зоне микроциркуляторного русла. Иммуностимулирующий эффект интракор- порального облучения крови проявляется в по- глощении клетками фотонов и переходе их в возбужденное состояние как в результате пря- мого взаимодействия энергии кванта с веществом клетки, так и в результате изменения структуры липидного бислоя цитомембраны, увеличения биосинтеза нуклеиновых кислот, сигнальных мо- лекул, активности экспрессии ферментов. Кро- ме того, образующиеся в крови фрагменты раз- рушенных и вновь синтезируемых белков могут играть роль антигенов, вызывая соответствую- щие иммунные реакции в организме [2, 6]. Внутривенное введение озоно-кислородной смеси сопровождается повышением содержания озонидов в крови, способствующих окислению макромолекул (белки, липиды, ДНК), образова- нию пероксидов, которые и участвуют в развитии воспалительного процесса. В свою очередь, сти- муляция клеток иммунной системы озонидами приводит к активации синтеза провоспалитель- ных медиаторов (лейкотриены, простагланди- ны), которые также обеспечивают формирование воспаления [8]. Следовательно, выбранные нами два метода, независимо от механизма их дей- ствия, имеют однонаправленный эффект на ре- активность иммунокомпетентных клеток, что позволяет использовать их в установлении роли СВ2-рецептора в иммунном ответе. Проведенные исследования по индуцирова- нию клеток иммунной системы in vivo показали, что в первой группе после интракорпорального облучения крови количество клеток, имеющих СВ2-рецепторы, составило менее 60% (рис. 2). Сравнительный анализ до воздействия интракор- порального облучения и после показал достовер- ное снижение СВ2-рецептора на 30% (р < 0,001). Полученные результаты свидетельствуют о бло- каде экспрессии эндоканнабиноидного СВ2-ре- цептора на поверхности МЛ. Во второй группе после введения внутривенно озоно-кислородной смеси количество клеток, содержащих СВ2-ре- цептор (рис. 3), также снизилось и не превышало 70%, что имело достоверное различие до воздей- ствия данного физического фактора (р < 0,001). Таким образом, в двух группах наблюдения отме- чается снижение числа клеток, экспрессирующих эндоканнабиноидный СВ2-рецептор. Вероятно, что такая однонаправленная реакция иммунной системы, независимо от механизма действия эф- фектора, свидетельствует об универсальности механизма иммунного ответа на флогоген и фор- мирование воспалительной реакции. Установленное подавление экспрессии эндо- каннабиноидного СВ2-рецептора на поверхно- сти МЛ при нагрузочных тестах in vivo является прямым доказательством того, что ЭКС участву- ет в регуляции иммунного ответа. Учитывая, что СВ2-рецепторы обладают иммунодепрессирую- щим действием на синтез провоспалительных медиаторов, снижение их экспрессии под дей ствием экзогенных иммуностимуляторов явля- ется первичной реакцией организма, которая запускает воспалительную реакцию и активиру- ет иммунную систему. Возможно, гиперреактив- ность иммунного ответа обусловлена активацией синтеза эндоканнабиноидов, обладающих бло- кирующим действием на экспрессию СВ2-ре- цепторов. Полученные данные свидетельствуют о зна- чимой роли ЭКС в регуляции иммунного ответа и могут быть использованы для целенаправлен- ного воздействия на воспалительную реакцию организма через СВ2-рецептор. Список литературы 1. Виткина Т.И., Хмелева Е.В., Анто- нюк М.В., Новгородцев А.Д. Влияние медицин- ского озона на иммунометаболический статус больных хроническим бронхитом и артериаль- ной гипертензией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. – 2011. – № 40. – C. 81-86. 2. Иванов Е.М., Эндакова Э.А. Аутотранс- фузия ультрофиолетом облученной крови. – Вла- дивосток: Дальнаука, 1993. – 103 с. 3. Исаченко Е.Г., Виткина Т.И., Герони- на С.А. Потапов В.Н., Бердышев Е.В. Спонтан- ный и липополисахарид индуцированный син- тез цитокинов клетками крови человека в норме и при аллергопатологиях // Иммунология. – 1999. – № 5. – C. 37-39. 4. Исаченко Е.Г., Виткина Т.И., Берды- шев Е.В. Влияние лигандов каннабиноидных рецепторов WIN 55,212-2 и анандамида на выра- ботку TNF-a и ИЛ-8 лейкоцитами крови здоро- вых лиц и больных с аллергопатологией // Им- мунопатология, аллергология, инфектология. – 2003. – Т. 2. – С. 86-91. 5. Клауса Дж. Лимфоциты: методы. – М.: Мир, 1990. – 395 с. 6. Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Бабенко- ва И.В., Башкуева Т.Ю., Модестова Т.М., Стекло- ва Л.С., Владимиров Ю.А. Влияние низкоинтен- сивного лазерного излучения на функциональ- ный потенциал лейкоцитов // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. – 1997. – Т. 123 (4). – С. 395-398. 7. Моделирование и клиническая харак- теристика фагоцитарных реакций / Под ред. А.Н. Маянского. – Горький: Изд-во Горьк. мед. института, 1989. – 242 с. 8. Техника озонотерапии: Методич. ре- комендации / С.П. Перетягин, Г.А. Бояринов, Д.М. Зеленов и др. – Н. Новгород, 1991. – 15 с. 1. Чурюканов М.В., Чурюканов В.В. Функ- циональная организация и терапевтический по- тенциал эндогенной каннабиноидной системы // Эксперим. и клинич. фармакология. – 2004. – Т. 67 (2). – С. 70-78. 2. Devane W.A., Hanu L., Breuer A. et al. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor // Science. – 1992. – Vol. 258. – P. 1946-1949. 3. Galiegue S., Mary S., Marchand J. et al. Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte subpopulations // Eur. J. Biochem. – 1995. – Vol. 232. – P. 54-61. 4. Han K.H., Lim S., Ryu J., Lee C.-W., Kim Y., Kang J.-H., Kang S.-S., Ahn Y.K., Park C.-S., Kim J.J. CB1 and CB2 cannabinoid receptors differentially regulate the production of reactive oxygen species by macrophages // J. Cardiovasc Res. December 1. – 2009. – Vol. 84 (3). – P. 378-386. 5. Kurihara R., Tohyama Y., Matsusaka S. et al. Effects of peripheral cannabionoid receptor ligands on motility and polarization in neutrophil-like HL60 cells and human neutrophils // J. Biol. Chem. – 2006. – Vol. 281. – P. 12908-12918. 6. M rquez L., Abanades S., Andreu M. Endocannabinoid system and bowel inflammation // Med. Clin. (Barc). – 2008. – Vol. 131 (13). – P. 513- 517. 7. Munro S., Thomas K.L., Abu-Shaar M. Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids // Nature. – 1993. – Vol. 365. – P. 61-65. 8. Orgado J.M., Fern ndez-Ruiz J., Romero J. The endocannabinoid system in neuropathological states // Int. Rev. Psychiatry. – 2009. – Vol. 21 (2). – Р. 172-180. 9. Pertwee R.G. Pharmacology of cannabinoid receptor ligands // Cur. Med. Chem. – 1999. – Vol. 6. – P. 635-664. поступила в редакцию 14.08.2011 отправлена на доработку 28.09.2011 принята к печати 04.10.2011 Каннабидиол (КБД, CBD) - не психоактивен, обладает антиконвульсивным действием, препятствует развитию панических реакций. Каннабинол ( КБН, CBN) - продукт окисления ТГК, его действие примерно в 10 раз слабее. Поделиться сообщением Ссылка на сообщение Поделиться на других сайтах
ejik 380 Опубликовано: 15 октября, 2018 Интересные статьи Поделиться сообщением Ссылка на сообщение Поделиться на других сайтах
Рекомендованные сообщения
Создайте аккаунт или войдите в него для комментирования
Вы должны быть пользователем, чтобы оставить комментарий
Создать аккаунт
Зарегистрируйтесь для получения аккаунта. Это просто!
Зарегистрировать аккаунтВойти
Уже зарегистрированы? Войдите здесь.
Войти сейчас